大(da)鼠甲(jia)狀(zhuang)腺(xian)上皮細(xi)胞(bao)

大(da)鼠甲(jia)狀(zhuang)腺(xian)上皮細(xi)胞(bao)需(xu)要(yao)準備(bei)好細(xi)胞所(suo)要(yao)用到(dao)的(de)培(pei)養(yang)基和相(xiang)關(guan)試(shi)劑(ji)，雖(sui)然(ran)所有的(de)貼壁(bi)，半貼壁(bi)或(huo)者(zhe)懸浮(fu)細(xi)胞(bao)處理方式(shi)差(cha)不(bu)多(duo)，但是不(bu)同(tong)的(de)實(shi)驗(yan)室培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)和(he)處理力度(du)還(hai)有試劑(ji)的(de)批間差(cha)這些(xie)問題(ti)存(cun)在，也會導(dao)致對細(xi)胞處理不(bu)當(dang)，  或(huo)者(zhe)環境(jing)的(de)不(bu)適(shi)應(ying)而(er)造成(cheng)細(xi)胞的(de)死(si)亡。
大(da)鼠甲(jia)狀(zhuang)腺(xian)上皮細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)物(wu)的(de)生理環境(jing)不(bu)同(tong)時定義為(wei)其物理(li)化學(xue)環(huan)境(jing)中(zhong)，更(geng)好地理(li)解血(xue)清(qing)的(de)組(zu)件，所(suo)必需(xu)的(de)增殖(zhi)的(de)生長因(yin)子的(de)鑒(jian)定，並更(geng)好地理(li)解細(xi)胞(bao)在培(pei)養(yang)的(de)微環境(jing)（即(ji)，細(xi)胞(bao) - 細胞相(xiang)互(hu)作用，氣(qi)體(ti)的(de)擴散，與基質相(xiang)互(hu)作用）現在允(yun)許在無(wu)血清培(pei)養(yang)基中(zhong)某(mou)些(xie)細胞(bao)系(xi)的(de)培(pei)養(yang)。
培(pei)養(yang)物(wu)的(de)主(zhu)要(yao)優(you)點(dian)是(shi)操縱(zong)物理化(hua)學(xue)（即(ji)，溫度(du)，pH，滲(shen)透(tou)壓(ya)，O2和CO2張(zhang)力）和(he)生理環(huan)境(jing)（即(ji)，激素(su)和(he)營養(yang)物(wu)濃(nong)度(du)），其中(zhong)所(suo)述(shu)細(xi)胞(bao)繁(fan)殖的(de)能力。除(chu)溫度(du)，將培(pei)養(yang)環(huan)境(jing)是(shi)由生長培(pei)養(yang)基進行(xing)控制(zhi)。
對於培(pei)養(yang)，只(zhi)要(yao)我們(men)細(xi)心(xin)操作，註意細節，並(bing)不(bu)是(shi)大(da)家說的(de)那樣(yang)困(kun)難。對於有經(jing)驗(yan)和有條件(jian)的(de)客(ke)戶，建(jian)議(yi)由公司(si)代為(wei)培(pei)養(yang)細(xi)胞(bao)及(ji)進行(xing)後(hou)續研究。

細胞(bao)復(fu)蘇(su)技(ji)術：

1. 取出細(xi)胞(bao)，迅速放(fang)入37℃溫水(shui)中(zhong)快(kuai)速(su)解(jie)凍(dong)

2. 吸出(chu)細胞(bao)懸液,並(bing)加(jia)10倍以(yi)上培(pei)養(yang)液(ye)

3. 1000r/分鐘離心5分鐘，去除上清

4. 用培(pei)養(yang)液(ye)適(shi)當(dang)稀釋後(hou)接種培(pei)養(yang)瓶(ping),放(fang)入(ru)37℃ CO2培(pei)養(yang)箱(xiang)靜(jing)置(zhi)培(pei)養(yang)

5. 鏡檢(jian)細胞(bao)貼壁(bi)能力，次(ci)日更(geng)換(huan)壹次培(pei)養(yang)液(ye),繼(ji)續培(pei)養(yang)

培(pei)養(yang)方(fang)法：

收到(dao)細(xi)胞後(hou)，在倒置(zhi)顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)整(zheng)個細胞生長情(qing)況：

如果細(xi)胞未(wei)長滿(man)，用75%酒精噴(pen)灑(sa)整(zheng)個瓶消(xiao)毒後(hou)放到(dao)超(chao)菌(jun)臺內(nei)，嚴(yan)格(ge)無(wu)菌(jun)操作，打開細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)瓶(ping)，留(liu)10ml培(pei)養(yang)液(ye)繼(ji)續培(pei)養(yang)。

如果細(xi)胞已(yi)長滿(man)（達(da)80-90%）。即(ji)可進行(xing)傳(chuan)代，具(ju)體(ti)步驟如下(xia)：

a，棄去培(pei)養(yang)液(ye)，用PBS洗1-2次(ci)。

b，向(xiang)瓶(ping)內(nei)加(jia)入1.0-2.0ml酶(mei)液，在倒置(zhi)顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細胞消(xiao)化(hua)情(qing)況，若(ruo)細胞(bao)大(da)部分變圓，迅速拿回操作臺，吸取酶(mei)，加(jia)含(han)有6ml 含(han)10%血清(qing)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)，輕輕吹打細(xi)胞(bao)。

c，加(jia)入等(deng)量(liang)的(de)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)，輕輕吹打混(hun)勻後(hou)吸出(chu)壹(yi)半(ban)，分到(dao)新(xin)的(de)培(pei)養(yang)

d，傳(chuan)代比(bi)例：1:2-1:3

保存(cun)和(he)應(ying)用：

客(ke)戶可以(yi)根(gen)據自己的(de)需求選擇新(xin)鮮(xian)或(huo)者(zhe)凍(dong)存(cun)的(de)原代細(xi)胞(bao)，如是新(xin)鮮(xian)原代細(xi)胞(bao)，客(ke)戶收(shou)到(dao)細(xi)胞後(hou)應(ying)立(li)即(ji)將其放入(ru)CO2細胞(bao)培(pei)養(yang)箱(xiang)內(nei)靜(jing)置(zhi)後(hou)2-3h，再進行(xing)後(hou)續的(de)實(shi)驗(yan)操作。如是凍(dong)存(cun)細(xi)胞，客(ke)戶收(shou)到(dao)細(xi)胞後(hou)應(ying)立(li)即(ji)將其放入(ru)液氮(dan)、-80℃冰(bing)箱或(huo)立即(ji)進行(xing)復(fu)蘇(su)。

細胞(bao)復(fu)蘇(su)的(de)原則：

在實(shi)際(ji)操作中(zhong)，凍(dong)存(cun)細(xi)胞要(yao)進行(xing)復(fu)蘇(su)，再培(pei)養(yang)傳(chuan)代。復(fu)蘇(su)細(xi)胞壹(yi)般(ban)采(cai)用快(kuai)速(su)融(rong)化法。以(yi)保證(zheng)細胞(bao)外(wai)結(jie)晶(jing)快(kuai)速(su)融(rong)化，以(yi)避(bi)免慢(man)速融(rong)化水(shui)分滲入細(xi)胞(bao)內(nei)，再次形成胞內(nei)結(jie)晶(jing)損傷(shang)細胞(bao)。

1）該(gai)細胞(bao)只能用於科研(yan)，不(bu)得用於臨床(chuang)。

2）收到(dao)細(xi)胞後(hou)首先(xian)觀(guan)察(cha)細胞瓶(ping)是(shi)否完好(hao)，培(pei)養(yang)液(ye)是(shi)否有漏液(ye)、渾(hun)濁等(deng)現象(xiang)，若(ruo)有上述(shu)現象(xiang)發(fa)生請及(ji)時和我們(men)聯系(xi)。

3）仔細(xi)閱(yue)讀(du)細胞說明書(shu)，了(le)解(jie)細胞相(xiang)關(guan)信息，如細胞(bao)形態(tai)、所(suo)用培(pei)養(yang)基、血清(qing)比例、所需細胞(bao)因(yin)子等(deng)。

4）用75%酒精擦拭(shi)細(xi)胞(bao)瓶(ping)表(biao)面(mian)，顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細胞狀(zhuang)態(tai)。因(yin)運(yun)輸問題(ti)貼壁(bi)細胞(bao)會有少(shao)量(liang)從瓶(ping)壁(bi)脫落，將細(xi)胞置於培(pei)養(yang)箱(xiang)內(nei)靜(jing)置(zhi)培(pei)養(yang)過夜(ye)，隔(ge)天(tian)再取出觀(guan)察(cha)。此(ci)時多數細(xi)胞(bao)均(jun)會貼壁(bi)，若(ruo)細胞(bao)仍不(bu)能貼壁(bi)請用臺盼藍(lan)染色(se)測(ce)定細胞活力，如果證(zheng)實(shi)細(xi)胞活力正(zheng)常，請將細(xi)胞離心後(hou)用新鮮(xian)培(pei)養(yang)基再次貼壁(bi)培(pei)養(yang)；如果染色(se)結(jie)果(guo)顯示(shi)細(xi)胞(bao)無(wu)活力，請拍(pai)下(xia)照(zhao)片及時和我們(men)聯系(xi)，信息確(que)認(ren)後(hou)我們(men)為(wei)您(nin)再免費寄(ji)送壹(yi)次(ci)。

5）請客(ke)戶用相(xiang)同(tong)條(tiao)件的(de)培(pei)養(yang)基用於細胞(bao)培(pei)養(yang)。培(pei)養(yang)瓶(ping)內(nei)多(duo)余(yu)的(de)培(pei)養(yang)基可收(shou)集備用，細胞(bao)傳(chuan)代時可以(yi)壹定比(bi)例和客(ke)戶自備的(de)培(pei)養(yang)基混合，使(shi)細胞(bao)逐(zhu)漸(jian)適(shi)應(ying)培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian);建(jian)議(yi)直(zhi)接購(gou)買(mai)我司(si)提供的(de)培(pei)養(yang)基。

6）建議(yi)客(ke)戶收(shou)到(dao)細(xi)胞後(hou)qian3天各(ge)拍(pai)幾張(zhang)細(xi)胞(bao)照(zhao)片，記錄(lu)細(xi)胞狀(zhuang)態(tai)，便(bian)於和我司(si)技術部溝(gou)通交流(liu)。

細胞(bao)培(pei)養(yang)操作

1）復(fu)蘇(su)細(xi)胞：將含(han)有1 mL細胞(bao)懸液(ye)的(de)凍(dong)存(cun)管在 37℃水(shui)浴(yu)中(zhong)迅(xun)速搖(yao)晃解(jie)凍(dong)，加(jia)4 mL培(pei)養(yang)基混合均(jun)勻。在1000 rpm條(tiao)件下(xia)離(li)心(xin)3 min，棄(qi)去上清液(ye)，加(jia)1-2 mL培(pei)養(yang)基後(hou)吹勻。然(ran)後(hou)將所(suo)有細胞(bao)懸液(ye)加(jia)入含(han)適量(liang)培(pei)養(yang)基的(de)培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)培(pei)養(yang)過夜(ye)（或(huo)將細(xi)胞懸液加(jia)入10 cm皿(min)中(zhong)，加(jia)入約(yue)8 mL培(pei)養(yang)基，培(pei)養(yang)過夜(ye)）。第(di)二(er)天(tian)換(huan)液並檢(jian)查(zha)細(xi)胞密度(du)。

2）細胞(bao)傳(chuan)代：如果細(xi)胞密(mi)度(du)達(da)80%-90%，即(ji)可進行(xing)傳(chuan)代培(pei)養(yang)。

a、棄去培(pei)養(yang)上清，用不(bu)含(han)鈣、鎂(mei)離(li)子的(de)PBS潤洗細胞1-2次(ci)。

b、加(jia)1 mL消(xiao)化(hua)液培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)，使(shi)消(xiao)化(hua)液浸潤(run)所有細胞(bao)，將培(pei)養(yang)瓶(ping)置(zhi)於37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)消(xiao)化(hua)1-2 min（視(shi)細(xi)胞(bao)情(qing)況而(er)定(ding)），然(ran)後(hou)在顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細胞消(xiao)化(hua)情(qing)況，若(ruo)細胞(bao)大(da)部分變圓並脫落，迅(xun)速(su)拿回操作臺，輕敲(qiao)幾(ji)下(xia)培(pei)養(yang)瓶(ping)後(hou)加(jia)2-3ml培(pei)養(yang)基終(zhong)止(zhi)消(xiao)化(hua)。輕輕打勻後(hou)裝入無(wu)菌(jun)離心管中(zhong)，1000 rpm離(li)心5 min，棄去上清液(ye)，補加(jia)1-2 mL培(pei)養(yang)液(ye)後(hou)吹勻。

c、將細(xi)胞懸液按1:2比(bi)例分到(dao)新(xin)的(de)含(han)8 mL培(pei)養(yang)基的(de)新皿(min)中(zhong)或(huo)者(zhe)瓶中(zhong)，置(zhi)於培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)培(pei)養(yang)。

3）細胞(bao)凍(dong)存(cun)：待(dai)細(xi)胞生長狀(zhuang)態(tai)良(liang)好時，可進行(xing)細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)。下(xia)面(mian) T25 瓶(ping)為(wei)例；

a、收集細胞，裝入無(wu)菌(jun)離心管中(zhong)，1000 rpm條(tiao)件下(xia)離(li)心(xin)4 min，棄(qi)去上清液(ye)，用PBS清洗(xi)壹(yi)遍(bian)，棄(qi)盡(jin)PBS，進行(xing)細(xi)胞(bao)計數(shu)。

b、根(gen)據細胞數量(liang)加(jia)入無(wu)血清細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)液(ye)，使(shi)細胞(bao)密(mi)度(du)5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支(zhi)凍(dong)存(cun)管凍(dong)存(cun)1mL細(xi)胞懸液，註意凍(dong)存(cun)管做(zuo)好(hao)標識(shi)。

c、將凍(dong)存(cun)管放入(ru)-80℃冰(bing)箱，24 h後(hou)轉入(ru)液(ye)氮(dan)灌(guan)儲(chu)存(cun)。記錄(lu)凍(dong)存(cun)管位置(zhi)以(yi)便下(xia)次(ci)拿(na)取。

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