小鼠胰(yi)島(dao)細(xi)胞

小鼠胰(yi)島(dao)細(xi)胞需(xu)要準(zhun)備好細(xi)胞所要(yao)用到的培養(yang)基(ji)和(he)相關(guan)試劑，雖(sui)然(ran)所有(you)的(de)貼(tie)壁，半(ban)貼(tie)壁或(huo)者(zhe)懸(xuan)浮(fu)細(xi)胞處理方(fang)式(shi)差不多(duo)，但是不同(tong)的實(shi)驗室(shi)培養(yang)條件(jian)和(he)處理力度(du)還(hai)有試劑的(de)批(pi)間(jian)差這些問(wen)題(ti)存(cun)在，也(ye)會導(dao)致(zhi)對細(xi)胞處理不(bu)當(dang)，  或(huo)者(zhe)環境的不(bu)適應(ying)而(er)造成細(xi)胞的死亡(wang)。
小鼠胰(yi)島(dao)細(xi)胞培養(yang)物(wu)的生(sheng)理環境不同(tong)時定(ding)義為(wei)其(qi)物(wu)理化(hua)學環境中，更(geng)好(hao)地理解(jie)血(xue)清的(de)組件(jian)，所必(bi)需(xu)的增(zeng)殖的生(sheng)長(chang)因子的(de)鑒(jian)定，並(bing)更好地理解(jie)細(xi)胞在培養(yang)的微(wei)環境（即，細(xi)胞 - 細(xi)胞相互(hu)作(zuo)用，氣(qi)體的(de)擴散，與(yu)基(ji)質(zhi)相(xiang)互(hu)作(zuo)用）現在允許在無(wu)血清(qing)培養(yang)基(ji)中(zhong)某些細(xi)胞系的(de)培養(yang)。
小鼠胰(yi)島(dao)細(xi)胞培養(yang)物(wu)的主要(yao)優點是操(cao)縱物(wu)理化(hua)學（即，溫(wen)度(du)，pH，滲透(tou)壓(ya)，O2和(he)CO2張力）和(he)生理環境（即，激(ji)素(su)和(he)營養(yang)物(wu)濃(nong)度(du)），其(qi)中所(suo)述細(xi)胞繁殖的能(neng)力。除(chu)溫(wen)度(du)，將(jiang)培養(yang)環境是由(you)生(sheng)長(chang)培養(yang)基(ji)進(jin)行控(kong)制。
小鼠胰(yi)島(dao)細(xi)胞對於(yu)培養(yang)，只(zhi)要我們細(xi)心操(cao)作(zuo)，註意細(xi)節(jie)，並(bing)不(bu)是(shi)大家說的(de)那(na)樣困難(nan)。對於(yu)有經(jing)驗和(he)有條(tiao)件(jian)的客(ke)戶，建(jian)議由(you)公(gong)司(si)代為(wei)培養(yang)細(xi)胞及進(jin)行後(hou)續(xu)研(yan)究。

細(xi)胞復蘇技術：

1. 取(qu)出(chu)細(xi)胞，迅(xun)速(su)放(fang)入37℃溫(wen)水中快(kuai)速(su)解(jie)凍(dong)

2. 吸(xi)出(chu)細(xi)胞懸(xuan)液,並加(jia)10倍(bei)以(yi)上(shang)培養(yang)液

3. 1000r/分鐘(zhong)離(li)心5分鐘(zhong)，去(qu)除(chu)上(shang)清(qing)

4. 用培養(yang)液適當(dang)稀(xi)釋(shi)後(hou)接種(zhong)培養(yang)瓶,放(fang)入37℃ CO2培養(yang)箱靜(jing)置(zhi)培養(yang)

5. 鏡檢(jian)細(xi)胞貼(tie)壁能(neng)力，次(ci)日(ri)更(geng)換(huan)壹(yi)次培養(yang)液,繼(ji)續(xu)培養(yang)

培養(yang)方法(fa)：

收到細(xi)胞後，在倒置(zhi)顯(xian)微鏡下觀(guan)察(cha)整(zheng)個細(xi)胞生長(chang)情況(kuang)：

如果細(xi)胞未(wei)長(chang)滿(man)，用(yong)75%酒精(jing)噴灑(sa)整個瓶(ping)消(xiao)毒後(hou)放到超菌臺內，嚴(yan)格(ge)無(wu)菌操(cao)作(zuo)，打開細(xi)胞培養(yang)瓶，留(liu)10ml培養(yang)液繼(ji)續(xu)培養(yang)。

如果細(xi)胞已(yi)長(chang)滿(man)（達(da)80-90%）。即可進(jin)行傳代，具(ju)體步(bu)驟(zhou)如下(xia)：

a，棄去(qu)培養(yang)液，用PBS洗(xi)1-2次(ci)。

b，向瓶(ping)內加(jia)入1.0-2.0ml酶液，在倒置(zhi)顯(xian)微鏡下觀(guan)察(cha)細(xi)胞消(xiao)化(hua)情況(kuang)，若細(xi)胞大部分變圓(yuan)，迅(xun)速(su)拿回(hui)操(cao)作(zuo)臺，吸(xi)取(qu)酶，加(jia)含(han)有6ml 含(han)10%血清的培養(yang)液，輕輕吹打細(xi)胞。

c，加入等量的的(de)培養(yang)液，輕輕吹打混(hun)勻(yun)後(hou)吸(xi)出(chu)壹(yi)半(ban)，分(fen)到新的培養(yang)

d，傳代比(bi)例：1:2-1:3

保存(cun)和(he)應(ying)用：

客戶可以(yi)根(gen)據自己的(de)需(xu)求(qiu)選(xuan)擇新鮮或(huo)者(zhe)凍(dong)存(cun)的原(yuan)代細(xi)胞，如是(shi)新鮮原(yuan)代細(xi)胞，客戶收到細(xi)胞後應(ying)立即(ji)將(jiang)其(qi)放入CO2細(xi)胞培養(yang)箱內靜(jing)置(zhi)後(hou)2-3h，再進(jin)行後(hou)續(xu)的(de)實(shi)驗操(cao)作(zuo)。如是凍(dong)存(cun)細(xi)胞，客戶收到細(xi)胞後應(ying)立即(ji)將(jiang)其(qi)放入液氮、-80℃冰(bing)箱或(huo)立即(ji)進(jin)行復蘇。

細(xi)胞復蘇的原(yuan)則：

在實(shi)際操(cao)作(zuo)中，凍(dong)存(cun)細(xi)胞要進(jin)行復蘇，再培養(yang)傳代。復蘇細(xi)胞壹(yi)般(ban)采用(yong)快(kuai)速(su)融(rong)化(hua)法(fa)。以(yi)保(bao)證細(xi)胞外結(jie)晶(jing)快(kuai)速(su)融(rong)化(hua)，以(yi)避(bi)免慢速(su)融(rong)化(hua)水分滲入細(xi)胞內，再(zai)次形成(cheng)胞(bao)內結(jie)晶(jing)損傷(shang)細(xi)胞。

1）該(gai)細(xi)胞只(zhi)能用(yong)於(yu)科(ke)研，不(bu)得用(yong)於(yu)臨床。

2）收到細(xi)胞後首(shou)先(xian)觀(guan)察(cha)細(xi)胞瓶是(shi)否完好，培養(yang)液是否(fou)有(you)漏液、渾濁等現象(xiang)，若(ruo)有上(shang)述現象(xiang)發(fa)生(sheng)請(qing)及(ji)時和(he)我們聯(lian)系(xi)。

3）仔細(xi)閱讀細(xi)胞說明(ming)書(shu)，了(le)解細(xi)胞相關(guan)信息，如細(xi)胞形態(tai)、所用培養(yang)基(ji)、血(xue)清(qing)比(bi)例、所需(xu)細(xi)胞因子等。

4）用75%酒(jiu)精擦(ca)拭細(xi)胞瓶表(biao)面(mian)，顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)細(xi)胞狀態(tai)。因運(yun)輸問題(ti)貼(tie)壁細(xi)胞會有(you)少量從瓶(ping)壁脫(tuo)落，將(jiang)細(xi)胞置(zhi)於(yu)培養(yang)箱內靜(jing)置(zhi)培養(yang)過夜，隔(ge)天(tian)再(zai)取(qu)出(chu)觀(guan)察(cha)。此(ci)時(shi)多(duo)數(shu)細(xi)胞均(jun)會貼(tie)壁，若(ruo)細(xi)胞仍不能貼(tie)壁請(qing)用臺盼(pan)藍(lan)染(ran)色(se)測(ce)定(ding)細(xi)胞活力，如(ru)果證實(shi)細(xi)胞活力正(zheng)常，請(qing)將細(xi)胞離(li)心後用(yong)新鮮培養(yang)基(ji)再(zai)次(ci)貼(tie)壁培養(yang)；如果染(ran)色(se)結果顯示細(xi)胞無(wu)活力，請(qing)拍下照(zhao)片(pian)及(ji)時(shi)和(he)我們聯(lian)系(xi)，信息確認(ren)後(hou)我們為(wei)您(nin)再免(mian)費寄送(song)壹(yi)次。

5）請客(ke)戶用(yong)相(xiang)同(tong)條件(jian)的培養(yang)基(ji)用(yong)於(yu)細(xi)胞培養(yang)。培養(yang)瓶內多(duo)余的(de)培養(yang)基(ji)可收集(ji)備用，細(xi)胞傳代時(shi)可以(yi)壹(yi)定比(bi)例和(he)客戶自(zi)備的培養(yang)基(ji)混(hun)合(he)，使細(xi)胞逐(zhu)漸(jian)適應(ying)培養(yang)條件(jian);建(jian)議直接購(gou)買我司提供(gong)的培養(yang)基(ji)。

6）建(jian)議客(ke)戶收到細(xi)胞後qian3天(tian)各拍幾張細(xi)胞照(zhao)片(pian)，記(ji)錄細(xi)胞狀態(tai)，便於(yu)和(he)我司技術部溝(gou)通交流。

細(xi)胞培養(yang)操(cao)作(zuo)

1）復蘇細(xi)胞：將含(han)有1 mL細(xi)胞懸(xuan)液的凍(dong)存(cun)管在 37℃水浴(yu)中迅(xun)速(su)搖(yao)晃(huang)解凍(dong)，加4 mL培養(yang)基(ji)混(hun)合(he)均(jun)勻(yun)。在1000 rpm條件(jian)下離(li)心3 min，棄去(qu)上(shang)清液，加1-2 mL培養(yang)基(ji)後(hou)吹勻(yun)。然(ran)後將(jiang)所(suo)有(you)細(xi)胞懸(xuan)液加入含適量培養(yang)基(ji)的(de)培養(yang)瓶中(zhong)培養(yang)過夜（或(huo)將細(xi)胞懸(xuan)液加入10 cm皿中，加入約(yue)8 mL培養(yang)基(ji)，培養(yang)過夜）。第(di)二天(tian)換(huan)液並檢(jian)查細(xi)胞密(mi)度(du)。

2）細(xi)胞傳代：如(ru)果細(xi)胞密(mi)度(du)達(da)80%-90%，即(ji)可進(jin)行傳代培養(yang)。

a、棄去(qu)培養(yang)上清(qing)，用不(bu)含鈣、鎂(mei)離(li)子的(de)PBS潤(run)洗細(xi)胞1-2次。

b、加1 mL消(xiao)化(hua)液培養(yang)瓶中(zhong)，使消(xiao)化(hua)液浸潤(run)所(suo)有細(xi)胞，將培養(yang)瓶置(zhi)於(yu)37℃培養(yang)箱中消(xiao)化(hua)1-2 min（視(shi)細(xi)胞情況(kuang)而(er)定），然(ran)後在顯微鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細(xi)胞消(xiao)化(hua)情況(kuang)，若細(xi)胞大部分變圓(yuan)並(bing)脫(tuo)落，迅(xun)速(su)拿回(hui)操(cao)作(zuo)臺，輕敲(qiao)幾下(xia)培養(yang)瓶後(hou)加2-3ml培養(yang)基(ji)終(zhong)止(zhi)消(xiao)化(hua)。輕輕打勻(yun)後(hou)裝入無(wu)菌離(li)心管中(zhong)，1000 rpm離(li)心5 min，棄去(qu)上(shang)清液，補(bu)加(jia)1-2 mL培養(yang)液後吹勻(yun)。

c、將細(xi)胞懸(xuan)液按1:2比(bi)例分到新的含(han)8 mL培養(yang)基(ji)的(de)新皿中(zhong)或(huo)者(zhe)瓶(ping)中(zhong)，置(zhi)於(yu)培養(yang)箱中培養(yang)。

3）細(xi)胞凍(dong)存(cun)：待細(xi)胞生長(chang)狀(zhuang)態(tai)良好時，可進(jin)行細(xi)胞凍(dong)存(cun)。下面 T25 瓶為(wei)例；

a、收集(ji)細(xi)胞，裝入無(wu)菌離(li)心管中(zhong)，1000 rpm條(tiao)件(jian)下離(li)心4 min，棄去(qu)上(shang)清液，用PBS清(qing)洗(xi)壹(yi)遍，棄盡(jin)PBS，進(jin)行細(xi)胞計(ji)數(shu)。

b、根據(ju)細(xi)胞數量加入無(wu)血清(qing)細(xi)胞凍(dong)存(cun)液，使細(xi)胞密(mi)度(du)5×106~1×107/mL，輕輕混勻(yun)，每(mei)支(zhi)凍(dong)存(cun)管凍(dong)存(cun)1mL細(xi)胞懸(xuan)液，註意(yi)凍(dong)存(cun)管做(zuo)好(hao)標(biao)識。

c、將凍(dong)存(cun)管放(fang)入-80℃冰箱，24 h後轉(zhuan)入液氮灌(guan)儲存(cun)。記(ji)錄凍(dong)存(cun)管位置(zhi)以(yi)便下次(ci)拿取(qu)。

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