小鼠(shu)氣(qi)管(guan)和支氣管上皮細(xi)胞(bao)

小鼠(shu)氣(qi)管(guan)和支氣管上皮細(xi)胞(bao)需要準(zhun)備好細(xi)胞所(suo)要用(yong)到的(de)培養(yang)基和相(xiang)關試(shi)劑，雖(sui)然所(suo)有的(de)貼壁(bi)，半貼壁(bi)或(huo)者(zhe)懸浮(fu)細胞(bao)處(chu)理(li)方(fang)式(shi)差(cha)不多(duo)，但(dan)是不(bu)同的(de)實驗(yan)室培養(yang)條(tiao)件(jian)和處(chu)理(li)力度還(hai)有試(shi)劑(ji)的(de)批間差這(zhe)些(xie)問題存(cun)在，也(ye)會導(dao)致對細(xi)胞(bao)處(chu)理(li)不(bu)當，  或者(zhe)環(huan)境的(de)不適(shi)應而造成(cheng)細(xi)胞的(de)死亡(wang)。
小鼠(shu)氣(qi)管(guan)和支氣管上皮細(xi)胞(bao)培養(yang)物(wu)的(de)生(sheng)理(li)環(huan)境不(bu)同(tong)時定(ding)義為其(qi)物理(li)化(hua)學環境中，更(geng)好地(di)理解(jie)血清的(de)組(zu)件(jian)，所(suo)必需的(de)增殖的(de)生(sheng)長(chang)因(yin)子的(de)鑒定(ding)，並更(geng)好(hao)地理解(jie)細胞(bao)在培養(yang)的(de)微(wei)環境（即(ji)，細(xi)胞 - 細(xi)胞相(xiang)互作(zuo)用(yong)，氣體的(de)擴散(san)，與基質(zhi)相(xiang)互作(zuo)用(yong)）現在允許在無(wu)血清培養(yang)基中某(mou)些細(xi)胞系(xi)的(de)培養(yang)。
小鼠(shu)氣(qi)管(guan)和支氣管上皮細(xi)胞(bao)培養(yang)物(wu)的(de)主(zhu)要優(you)點是操縱(zong)物(wu)理化(hua)學（即，溫度，pH，滲透(tou)壓，O2和CO2張(zhang)力）和生(sheng)理(li)環(huan)境（即(ji)，激(ji)素和營(ying)養物濃度），其(qi)中所(suo)述(shu)細(xi)胞(bao)繁殖的(de)能力。除溫(wen)度(du)，將培養(yang)環(huan)境是由(you)生(sheng)長(chang)培養(yang)基進(jin)行(xing)控制(zhi)。
小鼠(shu)氣(qi)管(guan)和支氣管上皮細(xi)胞(bao)對於(yu)培養(yang)，只(zhi)要我(wo)們細(xi)心(xin)操作(zuo)，註(zhu)意(yi)細(xi)節(jie)，並不(bu)是大家說(shuo)的(de)那樣(yang)困(kun)難。對於(yu)有經(jing)驗(yan)和有(you)條件的(de)客戶(hu)，建(jian)議(yi)由(you)公(gong)司(si)代(dai)為(wei)培養(yang)細(xi)胞(bao)及(ji)進行(xing)後續(xu)研究。

細(xi)胞復(fu)蘇技術：

1. 取(qu)出細胞(bao)，迅(xun)速放入37℃溫水(shui)中快(kuai)速(su)解(jie)凍

2. 吸(xi)出細胞(bao)懸液(ye),並加(jia)10倍(bei)以上培養(yang)液(ye)

3. 1000r/分鐘(zhong)離(li)心(xin)5分鐘(zhong)，去(qu)除上清

4. 用(yong)培養(yang)液(ye)適(shi)當稀釋(shi)後(hou)接種(zhong)培養(yang)瓶(ping),放(fang)入37℃ CO2培養(yang)箱靜(jing)置培養(yang)

5. 鏡(jing)檢(jian)細(xi)胞(bao)貼壁能力，次(ci)日更(geng)換(huan)壹(yi)次(ci)培養(yang)液(ye),繼(ji)續培養(yang)

培養(yang)方(fang)法：

收(shou)到細胞(bao)後(hou)，在倒置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察(cha)整(zheng)個細胞(bao)生(sheng)長(chang)情(qing)況(kuang)：

如(ru)果細胞未長(chang)滿(man)，用(yong)75%酒(jiu)精噴(pen)灑(sa)整(zheng)個瓶消(xiao)毒(du)後放(fang)到超(chao)菌(jun)臺內(nei)，嚴格(ge)無(wu)菌(jun)操作(zuo)，打(da)開(kai)細胞(bao)培養(yang)瓶(ping)，留10ml培養(yang)液(ye)繼(ji)續培養(yang)。

如(ru)果細胞已長滿(man)（達80-90%）。即(ji)可進行傳(chuan)代(dai)，具(ju)體步(bu)驟如(ru)下(xia)：

a，棄(qi)去(qu)培養(yang)液(ye)，用(yong)PBS洗1-2次(ci)。

b，向(xiang)瓶內(nei)加(jia)入1.0-2.0ml酶液(ye)，在倒置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察(cha)細(xi)胞消化情(qing)況，若(ruo)細(xi)胞(bao)大部(bu)分變(bian)圓，迅(xun)速拿回(hui)操作(zuo)臺，吸(xi)取酶(mei)，加(jia)含有(you)6ml 含10%血清的(de)培養(yang)液(ye)，輕輕吹打(da)細(xi)胞。

c，加(jia)入等量的(de)的(de)培養(yang)液(ye)，輕輕吹打(da)混(hun)勻(yun)後(hou)吸(xi)出壹(yi)半，分到新(xin)的(de)培養(yang)

d，傳(chuan)代比例：1:2-1:3

保存(cun)和應用(yong)：

客(ke)戶(hu)可(ke)以(yi)根據自(zi)己的(de)需求(qiu)選(xuan)擇(ze)新(xin)鮮(xian)或(huo)者(zhe)凍存(cun)的(de)原代細(xi)胞(bao)，如(ru)是新(xin)鮮(xian)原代細(xi)胞(bao)，客戶(hu)收(shou)到細胞(bao)後(hou)應立(li)即將其(qi)放入CO2細(xi)胞培養(yang)箱內(nei)靜(jing)置後(hou)2-3h，再進行後續的(de)實驗(yan)操作(zuo)。如(ru)是凍存(cun)細胞，客(ke)戶(hu)收(shou)到細胞(bao)後(hou)應立(li)即將其(qi)放入液氮、-80℃冰(bing)箱或(huo)立(li)即進行(xing)復(fu)蘇。

細(xi)胞復(fu)蘇的(de)原則：

在實際(ji)操作(zuo)中，凍存(cun)細胞要進(jin)行(xing)復(fu)蘇，再培養(yang)傳(chuan)代(dai)。復(fu)蘇細胞壹(yi)般采(cai)用(yong)快(kuai)速(su)融(rong)化(hua)法。以(yi)保證細胞(bao)外結(jie)晶(jing)快(kuai)速(su)融(rong)化(hua)，以(yi)避(bi)免(mian)慢速融(rong)化(hua)水(shui)分滲入細胞(bao)內(nei)，再次(ci)形成(cheng)胞(bao)內(nei)結晶(jing)損(sun)傷(shang)細(xi)胞(bao)。

1）該(gai)細胞只能(neng)用(yong)於(yu)科(ke)研，不(bu)得用(yong)於(yu)臨床(chuang)。

2）收(shou)到細胞(bao)後(hou)首先(xian)觀察(cha)細胞(bao)瓶是否完(wan)好(hao)，培養(yang)液(ye)是否有(you)漏液、渾濁等現象，若(ruo)有(you)上述(shu)現象發(fa)生(sheng)請(qing)及(ji)時和我(wo)們聯(lian)系(xi)。

3）仔(zai)細閱(yue)讀細(xi)胞說(shuo)明(ming)書(shu)，了(le)解(jie)細胞(bao)相(xiang)關信(xin)息(xi)，如(ru)細(xi)胞(bao)形(xing)態(tai)、所(suo)用(yong)培養(yang)基、血清比(bi)例、所(suo)需細(xi)胞因(yin)子等。

4）用(yong)75%酒精(jing)擦拭(shi)細胞瓶表面，顯微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察(cha)細(xi)胞狀(zhuang)態(tai)。因(yin)運(yun)輸(shu)問題(ti)貼壁細胞會有少(shao)量從瓶壁(bi)脫落，將細(xi)胞(bao)置於(yu)培養(yang)箱內(nei)靜(jing)置培養(yang)過(guo)夜，隔(ge)天(tian)再取(qu)出觀察(cha)。此時多(duo)數(shu)細胞均(jun)會貼壁(bi)，若(ruo)細(xi)胞(bao)仍不(bu)能貼(tie)壁請(qing)用(yong)臺盼藍染(ran)色測定(ding)細胞(bao)活力，如(ru)果證實細胞(bao)活力正(zheng)常(chang)，請將細(xi)胞(bao)離(li)心(xin)後(hou)用(yong)新(xin)鮮(xian)培養(yang)基再(zai)次(ci)貼壁(bi)培養(yang)；如(ru)果染(ran)色結果顯示細胞(bao)無(wu)活力，請拍(pai)下(xia)照片及(ji)時和我(wo)們聯(lian)系(xi)，信(xin)息(xi)確認(ren)後我(wo)們為(wei)您(nin)再免(mian)費(fei)寄送(song)壹(yi)次(ci)。

5）請(qing)客戶(hu)用(yong)相(xiang)同條(tiao)件的(de)培養(yang)基用(yong)於(yu)細胞(bao)培養(yang)。培養(yang)瓶(ping)內(nei)多(duo)余的(de)培養(yang)基可(ke)收(shou)集備用(yong)，細胞(bao)傳代(dai)時可(ke)以壹(yi)定(ding)比例和客(ke)戶(hu)自(zi)備的(de)培養(yang)基混(hun)合，使細(xi)胞逐(zhu)漸適(shi)應培養(yang)條(tiao)件(jian);建(jian)議(yi)直接購(gou)買(mai)我(wo)司提(ti)供的(de)培養(yang)基。

6）建(jian)議(yi)客戶(hu)收(shou)到細胞(bao)後(hou)qian3天各拍(pai)幾張(zhang)細胞(bao)照(zhao)片，記(ji)錄細胞狀(zhuang)態(tai)，便(bian)於(yu)和我(wo)司技(ji)術(shu)部(bu)溝(gou)通交(jiao)流(liu)。

細(xi)胞培養(yang)操作(zuo)

1）復(fu)蘇細胞：將含有(you)1 mL細(xi)胞(bao)懸液(ye)的(de)凍存(cun)管在 37℃水(shui)浴(yu)中迅(xun)速搖(yao)晃解(jie)凍，加(jia)4 mL培養(yang)基混(hun)合均勻(yun)。在1000 rpm條件(jian)下(xia)離(li)心(xin)3 min，棄(qi)去(qu)上清液(ye)，加(jia)1-2 mL培養(yang)基後(hou)吹勻(yun)。然(ran)後將所(suo)有細(xi)胞懸液(ye)加(jia)入含適(shi)量培養(yang)基的(de)培養(yang)瓶(ping)中培養(yang)過(guo)夜（或(huo)將細(xi)胞(bao)懸液(ye)加(jia)入10 cm皿(min)中，加(jia)入約8 mL培養(yang)基，培養(yang)過(guo)夜）。第(di)二(er)天(tian)換(huan)液並檢查(zha)細胞(bao)密(mi)度(du)。

2）細(xi)胞傳代：如(ru)果細胞密度(du)達80%-90%，即(ji)可(ke)進行(xing)傳代培養(yang)。

a、棄(qi)去(qu)培養(yang)上清，用(yong)不含鈣(gai)、鎂離(li)子的(de)PBS潤洗細胞(bao)1-2次(ci)。

b、加(jia)1 mL消(xiao)化液(ye)培養(yang)瓶(ping)中，使(shi)消化(hua)液浸(jin)潤所(suo)有細(xi)胞，將培養(yang)瓶(ping)置(zhi)於(yu)37℃培養(yang)箱中消(xiao)化1-2 min（視(shi)細胞(bao)情(qing)況(kuang)而定(ding)），然後(hou)在顯微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察(cha)細(xi)胞消化情(qing)況，若(ruo)細(xi)胞(bao)大部(bu)分變(bian)圓並(bing)脫落，迅速拿回(hui)操作(zuo)臺，輕敲幾下(xia)培養(yang)瓶(ping)後(hou)加(jia)2-3ml培養(yang)基終止消(xiao)化。輕輕打(da)勻(yun)後(hou)裝(zhuang)入無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管(guan)中，1000 rpm離(li)心(xin)5 min，棄(qi)去(qu)上清液(ye)，補(bu)加(jia)1-2 mL培養(yang)液(ye)後(hou)吹勻(yun)。

c、將細(xi)胞(bao)懸液(ye)按(an)1:2比(bi)例分到新(xin)的(de)含8 mL培養(yang)基的(de)新(xin)皿(min)中或(huo)者(zhe)瓶(ping)中，置(zhi)於(yu)培養(yang)箱中培養(yang)。

3）細(xi)胞凍存(cun)：待細胞(bao)生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態(tai)良(liang)好時，可(ke)進行(xing)細胞(bao)凍存(cun)。下(xia)面 T25 瓶為(wei)例；

a、收(shou)集細胞，裝(zhuang)入無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管(guan)中，1000 rpm條(tiao)件下(xia)離(li)心(xin)4 min，棄(qi)去(qu)上清液(ye)，用(yong)PBS清洗(xi)壹(yi)遍(bian)，棄盡PBS，進行細胞計(ji)數(shu)。

b、根據細(xi)胞數(shu)量加(jia)入無(wu)血清細(xi)胞(bao)凍存(cun)液，使細(xi)胞(bao)密度5×106~1×107/mL，輕輕混(hun)勻(yun)，每(mei)支凍存(cun)管凍存(cun)1mL細胞懸液(ye)，註意(yi)凍存(cun)管做好(hao)標識(shi)。

c、將凍存(cun)管放入-80℃冰(bing)箱，24 h後(hou)轉(zhuan)入液氮灌(guan)儲存。記(ji)錄凍存(cun)管位(wei)置以(yi)便(bian)下(xia)次(ci)拿取(qu)。