小(xiao)鼠支(zhi)氣管上皮(pi)細胞

小(xiao)鼠支(zhi)氣管上皮(pi)細胞需要準備好細胞所(suo)要(yao)用(yong)到的培(pei)養(yang)基(ji)和(he)相(xiang)關試劑(ji)，雖(sui)然(ran)所(suo)有的貼(tie)壁(bi)，半貼(tie)壁(bi)或者(zhe)懸(xuan)浮細胞處理方(fang)式(shi)差不(bu)多，但是不(bu)同的實(shi)驗室培(pei)養(yang)條件(jian)和(he)處理力度(du)還(hai)有試劑(ji)的批間(jian)差這些(xie)問題存(cun)在，也(ye)會導致(zhi)對(dui)細胞處理不(bu)當，  或者(zhe)環(huan)境(jing)的不(bu)適應(ying)而造(zao)成(cheng)細胞的死(si)亡。
小(xiao)鼠支(zhi)氣管上皮(pi)細胞培(pei)養(yang)物的生(sheng)理(li)環(huan)境(jing)不同時(shi)定(ding)義為其(qi)物理化學環(huan)境(jing)中，更好地(di)理(li)解血清(qing)的組(zu)件(jian)，所(suo)必需的增(zeng)殖(zhi)的生(sheng)長(chang)因(yin)子的鑒(jian)定(ding)，並(bing)更(geng)好地(di)理(li)解細胞在培(pei)養(yang)的微環(huan)境(jing)（即(ji)，細胞 - 細胞相互(hu)作用(yong)，氣體的擴(kuo)散，與基(ji)質(zhi)相(xiang)互(hu)作用(yong)）現(xian)在允(yun)許在無血清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)中某些(xie)細胞系的培(pei)養(yang)。
小(xiao)鼠支(zhi)氣管上皮(pi)細胞培(pei)養(yang)物的主要優(you)點(dian)是(shi)操縱物理化學（即(ji)，溫度，pH，滲透(tou)壓(ya)，O2和CO2張力）和(he)生(sheng)理(li)環(huan)境(jing)（即(ji)，激素(su)和營養(yang)物濃度(du)），其(qi)中所(suo)述(shu)細胞繁殖的能(neng)力。除(chu)溫(wen)度，將(jiang)培(pei)養(yang)環(huan)境(jing)是由生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)基(ji)進(jin)行(xing)控制(zhi)。
小(xiao)鼠支(zhi)氣管上皮(pi)細胞對(dui)於(yu)培(pei)養(yang)，只要我(wo)們(men)細心操作，註意(yi)細節，並(bing)不(bu)是(shi)大家(jia)說(shuo)的那樣困難(nan)。對(dui)於(yu)有經驗和有條件的客(ke)戶，建(jian)議(yi)由(you)公司代(dai)為培(pei)養(yang)細胞及(ji)進(jin)行(xing)後續研究(jiu)。

細胞復蘇(su)技(ji)術：

1. 取(qu)出細胞，迅(xun)速(su)放入37℃溫水(shui)中快速(su)解凍

2. 吸出細胞懸液(ye),並(bing)加(jia)10倍(bei)以上培(pei)養(yang)液(ye)

3. 1000r/分鐘(zhong)離(li)心5分(fen)鐘，去(qu)除(chu)上(shang)清(qing)

4. 用(yong)培(pei)養(yang)液(ye)適當(dang)稀釋(shi)後(hou)接種(zhong)培(pei)養(yang)瓶,放入37℃ CO2培(pei)養(yang)箱靜置培(pei)養(yang)

5. 鏡(jing)檢細胞貼(tie)壁(bi)能(neng)力，次(ci)日(ri)更換(huan)壹(yi)次培(pei)養(yang)液(ye),繼續培(pei)養(yang)

培(pei)養(yang)方法(fa)：

收到細胞後，在倒置顯微鏡(jing)下觀察整(zheng)個細胞生(sheng)長(chang)情(qing)況：

如(ru)果(guo)細胞未長(chang)滿(man)，用(yong)75%酒(jiu)精(jing)噴灑整(zheng)個瓶消毒後(hou)放到超(chao)菌臺(tai)內(nei)，嚴格無(wu)菌操作，打(da)開細胞培(pei)養(yang)瓶，留10ml培(pei)養(yang)液(ye)繼續培(pei)養(yang)。

如(ru)果(guo)細胞已長(chang)滿(man)（達(da)80-90%）。即(ji)可進行(xing)傳代(dai)，具(ju)體步驟(zhou)如(ru)下：

a，棄去(qu)培(pei)養(yang)液(ye)，用(yong)PBS洗(xi)1-2次(ci)。

b，向瓶內(nei)加(jia)入1.0-2.0ml酶液(ye)，在倒置顯微鏡(jing)下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓，迅(xun)速(su)拿回(hui)操作臺(tai)，吸(xi)取(qu)酶，加(jia)含(han)有6ml 含(han)10%血清(qing)的培(pei)養(yang)液(ye)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)打細胞。

c，加(jia)入等量(liang)的的培(pei)養(yang)液(ye)，輕(qing)輕(qing)吹(chui)打混勻(yun)後吸(xi)出壹(yi)半，分(fen)到新的培(pei)養(yang)

d，傳代(dai)比例(li)：1:2-1:3

保存(cun)和應(ying)用(yong)：

客戶可以根據自己(ji)的需求選(xuan)擇新鮮(xian)或者(zhe)凍存(cun)的原(yuan)代(dai)細胞，如(ru)是(shi)新鮮(xian)原(yuan)代(dai)細胞，客戶收到細胞後應立即(ji)將(jiang)其(qi)放入CO2細胞培(pei)養(yang)箱內(nei)靜置後2-3h，再進行(xing)後(hou)續的實(shi)驗操作。如(ru)是(shi)凍存(cun)細胞，客戶收到細胞後應立即(ji)將(jiang)其(qi)放入液(ye)氮、-80℃冰(bing)箱或立即(ji)進行復蘇(su)。

細胞復蘇(su)的原(yuan)則(ze)：

在實(shi)際(ji)操作中，凍存(cun)細胞要進行(xing)復蘇(su)，再培(pei)養(yang)傳代(dai)。復蘇(su)細胞壹(yi)般采(cai)用(yong)快速(su)融(rong)化法。以保證細胞外(wai)結晶快速(su)融(rong)化，以避免(mian)慢(man)速(su)融(rong)化水(shui)分滲入細胞內(nei)，再次形成(cheng)胞內(nei)結晶損傷細胞。

1）該細胞只能(neng)用(yong)於(yu)科研，不得(de)用(yong)於(yu)臨(lin)床(chuang)。

2）收到細胞後首(shou)先(xian)觀(guan)察細胞瓶是否完(wan)好，培(pei)養(yang)液(ye)是否有漏液(ye)、渾濁(zhuo)等(deng)現象，若有上述現象(xiang)發(fa)生(sheng)請(qing)及(ji)時(shi)和(he)我們聯(lian)系。

3）仔細閱讀(du)細胞說明(ming)書，了解(jie)細胞相關信(xin)息(xi)，如(ru)細胞形態、所(suo)用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)、血清(qing)比例(li)、所(suo)需細胞因(yin)子等。

4）用(yong)75%酒(jiu)精(jing)擦拭(shi)細胞瓶表面(mian)，顯微鏡(jing)下觀察細胞狀(zhuang)態。因(yin)運輸(shu)問題貼(tie)壁(bi)細胞會有少量從瓶壁(bi)脫落(luo)，將(jiang)細胞置於培(pei)養(yang)箱內(nei)靜置培(pei)養(yang)過夜，隔天(tian)再取(qu)出觀察。此(ci)時多(duo)數(shu)細胞均會貼(tie)壁(bi)，若細胞仍(reng)不能(neng)貼(tie)壁(bi)請(qing)用(yong)臺(tai)盼(pan)藍(lan)染(ran)色(se)測(ce)定(ding)細胞活(huo)力，如(ru)果(guo)證(zheng)實(shi)細胞活(huo)力正(zheng)常(chang)，請(qing)將(jiang)細胞離(li)心後(hou)用(yong)新鮮(xian)培(pei)養(yang)基(ji)再次貼(tie)壁(bi)培(pei)養(yang)；如(ru)果(guo)染(ran)色(se)結果顯(xian)示細胞無活(huo)力，請(qing)拍下照片(pian)及(ji)時(shi)和(he)我們聯(lian)系，信(xin)息確認後(hou)我們為(wei)您再免(mian)費寄(ji)送(song)壹(yi)次。

5）請(qing)客戶用(yong)相(xiang)同(tong)條(tiao)件的培(pei)養(yang)基(ji)用(yong)於(yu)細胞培(pei)養(yang)。培(pei)養(yang)瓶內(nei)多余(yu)的培(pei)養(yang)基(ji)可收集備用(yong)，細胞傳代(dai)時可以壹(yi)定比例(li)和客戶自備的培(pei)養(yang)基(ji)混(hun)合(he)，使(shi)細胞逐漸(jian)適(shi)應(ying)培(pei)養(yang)條件(jian);建(jian)議(yi)直(zhi)接購買(mai)我司提(ti)供(gong)的培(pei)養(yang)基(ji)。

6）建(jian)議(yi)客(ke)戶收到細胞後qian3天(tian)各(ge)拍幾(ji)張細胞照片(pian)，記錄(lu)細胞狀(zhuang)態，便(bian)於(yu)和我司技(ji)術部溝通(tong)交流(liu)。

細胞培(pei)養(yang)操作

1）復蘇(su)細胞：將(jiang)含(han)有1 mL細胞懸液(ye)的凍存(cun)管在 37℃水(shui)浴(yu)中迅(xun)速(su)搖晃(huang)解(jie)凍，加(jia)4 mL培(pei)養(yang)基(ji)混(hun)合(he)均勻(yun)。在1000 rpm條件下離(li)心3 min，棄(qi)去上(shang)清(qing)液(ye)，加(jia)1-2 mL培(pei)養(yang)基(ji)後(hou)吹(chui)勻(yun)。然(ran)後將(jiang)所(suo)有細胞懸液(ye)加(jia)入含(han)適(shi)量培(pei)養(yang)基(ji)的培(pei)養(yang)瓶中培(pei)養(yang)過夜（或將(jiang)細胞懸液(ye)加(jia)入10 cm皿(min)中，加(jia)入約8 mL培(pei)養(yang)基(ji)，培(pei)養(yang)過夜）。第二天(tian)換(huan)液(ye)並(bing)檢(jian)查(zha)細胞密度。

2）細胞傳代(dai)：如(ru)果(guo)細胞密度達(da)80%-90%，即(ji)可進行(xing)傳代(dai)培(pei)養(yang)。

a、棄去(qu)培(pei)養(yang)上清(qing)，用(yong)不(bu)含(han)鈣(gai)、鎂離(li)子的PBS潤(run)洗(xi)細胞1-2次。

b、加(jia)1 mL消化液(ye)培(pei)養(yang)瓶中，使消化液(ye)浸潤(run)所(suo)有細胞，將(jiang)培(pei)養(yang)瓶置於37℃培(pei)養(yang)箱中消化1-2 min（視細胞情況而定(ding)），然(ran)後在顯微鏡(jing)下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓並(bing)脫(tuo)落(luo)，迅(xun)速(su)拿回(hui)操作臺(tai)，輕(qing)敲(qiao)幾(ji)下培(pei)養(yang)瓶後加(jia)2-3ml培(pei)養(yang)基(ji)終(zhong)止(zhi)消化。輕(qing)輕(qing)打(da)勻(yun)後裝入無菌離(li)心管(guan)中，1000 rpm離(li)心5 min，棄(qi)去上(shang)清(qing)液(ye)，補加(jia)1-2 mL培(pei)養(yang)液(ye)後吹(chui)勻(yun)。

c、將(jiang)細胞懸液(ye)按1:2比例(li)分到新的含(han)8 mL培(pei)養(yang)基(ji)的新皿(min)中或者(zhe)瓶中，置於培(pei)養(yang)箱中培(pei)養(yang)。

3）細胞凍存(cun)：待細胞生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態良(liang)好時(shi)，可進行(xing)細胞凍存(cun)。下面(mian) T25 瓶為例(li)；

a、收集細胞，裝入無菌離(li)心管(guan)中，1000 rpm條件(jian)下離(li)心4 min，棄(qi)去上(shang)清(qing)液(ye)，用(yong)PBS清(qing)洗(xi)壹(yi)遍，棄(qi)盡(jin)PBS，進行細胞計(ji)數(shu)。

b、根據細胞數(shu)量(liang)加(jia)入無血清(qing)細胞凍存(cun)液(ye)，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)，每(mei)支(zhi)凍存(cun)管凍存(cun)1mL細胞懸液(ye)，註意(yi)凍存(cun)管做(zuo)好標(biao)識。

c、將(jiang)凍存(cun)管放入-80℃冰箱，24 h後轉(zhuan)入液(ye)氮灌(guan)儲(chu)存(cun)。記錄(lu)凍存(cun)管位(wei)置以便下次拿取(qu)。

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