人原代(dai) Naive T cell

人(ren)原代(dai) Naive T cell

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細胞培(pei)養步驟(zhou)

1) 培(pei)養基及(ji)培(pei)養凍存(cun)條件(jian)準備：

1. 準備 McCOY's 5A 培(pei)養基(McCOY's 5A，SIGMA,貨(huo)號 M4892，添(tian)加 NaHC03 2.2g/L)，90%;you質(zhi)胎牛血(xue)清，10%。

2. 培(pei)養條件(jian)：氣相(xiang)：空氣(qi)，95%;碳，5%。溫度(du)：37攝(she)氏度(du)，培(pei)養箱濕(shi)度(du)為70%-80%。

3. 凍存(cun)液(ye)：90%培(pei)養基，10%DMSO,現(xian)用現(xian)配。液(ye)氮儲(chu)存(cun)。

2) 細胞處理(li)：

復蘇細胞：將含(han)有(you) lmL 細胞懸液(ye)的(de)凍存(cun)管在 37°C 水浴中迅速(su)搖晃(huang)解(jie)凍(dong)，加 入(ru) 4mL 培(pei)養基混(hun)合均(jun)勻。在 1000RPM 條件(jian)下離心(xin) 4分(fen)鐘，棄去(qu)上(shang)清液(ye)，補 加 l-2mL 培(pei)養基後(hou)吹勻。然後(hou)將所(suo)有細(xi)胞懸液(ye)加入(ru)培(pei)養瓶中培(pei)養過夜(ye)（或將 細(xi)胞懸液(ye)加入(ru) l〇cm皿中，加入(ru)約 8ml 培(pei)養基，培(pei)養過夜(ye)）。隔(ge)天(tian)換液(ye)並(bing)檢(jian)查(zha)細(xi)胞密度(du)。

細胞凍存(cun)：

待細(xi)胞生長(chang)狀(zhuang)態(tai)良(liang)好(hao)時，可進行細胞凍存(cun)。貼(tie)壁(bi)細(xi)胞凍存(cun)時(shi)，先要消(xiao)化處(chu)理並(bing)進(jin)行(xing)細(xi)胞計數(shu)。消(xiao)化方(fang)法(fa)按照細胞傳(chuan)代(dai)方法(fa)步驟(zhou)進(jin)行， 重懸液(ye)使(shi)用血(xue)清。懸浮(fu)細(xi)胞直接計(ji)數後(hou)離心(xin)，用(yong)血(xue)清重懸浮(fu)，加 DMSO 至最(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為10%。加入(ru) DMSO 後(hou)迅速(su)混(hun)勻，按(an)每 lml 的(de)數量(liang)分配到(dao)凍存(cun)管(guan)中。本公司按(an)每(mei)個(ge)凍(dong)存(cun)管(guan)細(xi)胞數目(mu)大(da)於 1X106個(ge)細(xi)胞凍存(cun)。

細胞接受(shou)後(hou)的(de)處理(li)：

1. 收到(dao)細胞後(hou)，請(qing)檢(jian)查(zha)是(shi)否(fou)漏(lou)液(ye)，如(ru)果漏(lou)液(ye)，請(qing)拍照(zhao)片(pian)發給(gei)我們。

2. 請(qing)先在顯微鏡下(xia)確(que)認細胞生長(chang)狀(zhuang)態(tai)，去(qu)掉(diao)封口(kou)膜並(bing)將 T25瓶(ping)置(zhi)於 37°C 培(pei)養約 2-3h〇

3. 棄去(qu) T25瓶(ping)中的(de)培(pei)養基，添(tian)加 6ml 本(ben)公司(si)附帶(dai)的(de)培(pei)養基。

4. 如(ru)果細(xi)胞長滿（90%以上(shang)）請(qing)及時(shi)進行細胞傳(chuan)代(dai)，傳(chuan)代(dai)培(pei)養用 6ml 本(ben)公司(si)附帶(dai)的(de)培(pei)養基。

5. 接到(dao)細胞次日，請(qing)檢(jian)查(zha)細(xi)胞是(shi)否(fou)汙(wu)染(ran)，若(ruo)發(fa)現汙染(ran)或疑(yi)似汙(wu)染，請(qing)及時(shi)與(yu)我(wo)們取(qu)得(de)聯系。

人原(yuan)代(dai) Naive T cell

培(pei)養方法(fa)：

收到(dao)細胞後(hou)，在倒置(zhi)顯微鏡下(xia)觀(guan)察整個(ge)細(xi)胞生長(chang)情(qing)況(kuang)：

如(ru)果細(xi)胞未(wei)長滿，用75%酒精(jing)噴灑整個(ge)瓶(ping)消(xiao)毒(du)後(hou)放到(dao)超菌(jun)臺內(nei)，嚴格(ge)無菌操(cao)作，打開細胞培(pei)養瓶，留(liu)10ml培(pei)養液(ye)繼續(xu)培(pei)養。

如(ru)果細(xi)胞已長(chang)滿（達80-90%）。即可進行傳(chuan)代(dai)，具(ju)體步驟(zhou)如(ru)下：

a，棄去(qu)培(pei)養液(ye)，用PBS洗(xi)1-2次。

b，向瓶(ping)內(nei)加入(ru)1.0-2.0ml酶(mei)液(ye)，在倒置(zhi)顯微鏡下(xia)觀(guan)察細(xi)胞消化情(qing)況(kuang)，若細胞大(da)部(bu)分(fen)變圓，迅速(su)拿回(hui)操(cao)作臺，吸(xi)取(qu)酶(mei)，加含(han)有6ml 含(han)10%血(xue)清(qing)的(de)培(pei)養液(ye)，輕(qing)輕(qing)吹打細胞。

c，加入(ru)等量(liang)的(de)的(de)培(pei)養液(ye)，輕(qing)輕(qing)吹打混(hun)勻後(hou)吸(xi)出(chu)壹半，分到(dao)新(xin)的(de)培(pei)養

d，傳(chuan)代(dai)比例：1:2-1:3

對(dui)於懸浮(fu)細(xi)胞，傳(chuan)代(dai)可參考(kao)以下(xia)方法(fa)：

方法(fa)壹：收(shou)集細胞，1000RPM，常溫(wen)條(tiao)件(jian)下離心(xin) 5分(fen)鐘，棄去(qu)上(shang)清液(ye)，補加 l-2mL 培(pei)養液(ye)後(hou)吹句，將細(xi)胞懸液(ye)按 1: 2到(dao) 1: 5的(de)比例(li)分到(dao)新(xin)的(de)含 8ml 培(pei) 養基的(de) 新(xin)皿中或者瓶中。

方法(fa)二(er)：可選(xuan)擇(ze)半數換液(ye)方式(shi)，棄去(qu)半數培(pei)養基後(hou)，將剩(sheng)余細胞懸起，將細(xi) 胞懸 液(ye)按 1: 2到(dao) 1: 3的(de)比例(li)分到(dao)新(xin)的(de)含 8ml 培(pei)養基的(de)新(xin)皿中或者瓶中。

操作要點(dian)：

1）將培(pei)養基在37℃水浴鍋(guo)預(yu)熱(re)；準(zhun)備壹個(ge)15mL無菌的(de)離心(xin)管(guan)，加入(ru)8mL預(yu)熱(re)培(pei)養基。

2）將凍(dong)存(cun)細胞從(cong)液(ye)氮罐(guan)中取(qu)出(chu)，快速(su)放入(ru)37℃水浴鍋(guo)中復溫（可準備壹潔凈的(de)燒杯，裝滿37℃的(de)水，細(xi)胞凍存(cun)管(guan)取(qu)出(chu)後(hou)迅速(su)放入(ru)燒(shao)杯內(nei)，再(zai)逐步轉(zhuan)移到(dao)水浴鍋(guo)中）。輕(qing)輕(qing)晃(huang)動凍(dong)存管(guan)，使(shi)細胞能(neng)在1~2min內(nei)解(jie)凍(dong)，使(shi)細胞能(neng)盡快通(tong)過(guo)易受(shou)損的(de)溫度(du)段(duan)（-5~0℃）。註(zhu)意(yi)凍(dong)存(cun)管管(guan)口(kou)不能(neng)沒入水中，避免引(yin)起汙染。

3）用75%酒(jiu)精(jing)擦拭凍存管後(hou)再置(zhi)於超(chao)凈(jing)臺內(nei)，將管(guan)內(nei)細(xi)胞轉移至準(zhun)備好(hao)的(de)離心(xin)管(guan)內(nei)，輕(qing)輕(qing)吹打液(ye)體，使(shi)細胞均(jun)勻分(fen)散，吹打時避免產(chan)生(sheng)氣泡(pao)。用新(xin)鮮培(pei)養基洗(xi)管壁(bi)2次，均(jun)轉移至離心(xin)管(guan)內(nei)。

4）800rpm離心(xin)5min，棄(qi)上(shang)清，加入(ru)新(xin)鮮的(de)培(pei)養基，吹打制成細胞懸液(ye)。

5）將細(xi)胞懸液(ye)轉移至T25細(xi)胞瓶內(nei)，補加適(shi)量的(de)培(pei)養基，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動細(xi)胞瓶使(shi)細胞分布(bu)均(jun)勻，放(fang)入溫(wen)箱內(nei)培(pei)養。

6）隔(ge)天(tian)觀(guan)察細(xi)胞貼(tie)壁(bi)生(sheng)長情(qing)況(kuang)，換新(xin)鮮培(pei)養基以(yi)去(qu)除(chu)死細(xi)胞。繼續(xu)培(pei)養，待細(xi)胞長至(zhi)80~90%匯合(he)時(shi)正常(chang)傳(chuan)代(dai)。壹般剛復(fu)蘇的(de)細胞需經(jing)過(guo)2~3次傳(chuan)代(dai)，細胞活(huo)力(li)恢復後(hou)才(cai)能(neng)進行(xing)後(hou)續的(de)實驗(yan)。

友(you)情(qing)提(ti)示(shi)註(zhu)意(yi)以(yi)下(xia)幾(ji)點：

1、收到(dao)細胞後(hou)請(qing)盡快更(geng)換為含15%血清(qing)的(de)新(xin)鮮培(pei)養基，如(ru)因(yin)特殊(shu)情(qing)況(kuang)需要繼(ji)續(xu)使(shi)用原(yuan)瓶，請(qing)在原瓶(ping)培(pei)養基中額外添加10%的(de)血清(qing)

2、貼(tie)壁(bi)細(xi)胞收到(dao)當(dang)天(tian)切忌立(li)刻(ke)消(xiao)化，請(qing)將細(xi)胞換液(ye)後(hou)放置(zhi)培(pei)養箱孵(fu)育到(dao)隔(ge)天(tian)再做(zuo)消(xiao)化傳(chuan)代(dai)，請(qing)優先(xian)選(xuan)擇(ze)直徑6cm的(de)培(pei)養皿進行(xing)傳(chuan)代(dai)培(pei)養

3、如(ru)簽收時出(chu)現(xian)培(pei)養瓶壁(bi)破裂，漏(lou)液(ye)等情(qing)況(kuang)請(qing)及時(shi)做(zuo)好(hao)照片(pian)記錄(lu)並(bing)聯(lian)系實驗(yan)室

細胞用途(tu)：僅供科研使(shi)用。