人(ren)造血幹(gan)細胞(bao)

人(ren)造血幹(gan)細胞(bao)

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細胞(bao)培養步驟(zhou)

1) 培養基(ji)及培養凍存條件準(zhun)備(bei)：

1. 準備(bei) McCOY's 5A 培養基(ji)(McCOY's 5A，SIGMA,貨(huo)號 M4892，添(tian)加(jia) NaHC03 2.2g/L)，90%;you質胎(tai)牛血清(qing)，10%。

2. 培養條件：氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%;碳(tan)，5%。溫度(du)：37攝氏度(du)，培養箱濕(shi)度(du)為70%-80%。

3. 凍存液：90%培養基(ji)，10%DMSO,現用現配。液氮儲存。

2) 細胞(bao)處理(li)：

復(fu)蘇細胞(bao)：將(jiang)含有(you) lmL 細胞(bao)懸液的凍(dong)存管(guan)在(zai) 37°C 水(shui)浴中迅速搖晃(huang)解凍(dong)，加(jia) 入(ru) 4mL 培養基(ji)混合(he)均(jun)勻。在(zai) 1000RPM 條件下(xia)離(li)心(xin) 4分(fen)鐘(zhong)，棄(qi)去(qu)上(shang)清(qing)液，補(bu) 加(jia) l-2mL 培養基(ji)後吹勻(yun)。然(ran)後(hou)將(jiang)所有(you)細胞(bao)懸液加(jia)入(ru)培養瓶中培養過夜(ye)（或將(jiang) 細胞(bao)懸液加(jia)入(ru) l〇cm皿(min)中(zhong)，加(jia)入(ru)約(yue) 8ml 培養基(ji)，培養過夜(ye)）。隔天(tian)換(huan)液並檢查(zha)細胞(bao)密度(du)。

細胞(bao)凍存：

待細胞(bao)生長狀(zhuang)態良好(hao)時(shi)，可(ke)進(jin)行細胞(bao)凍存。貼壁(bi)細胞(bao)凍存時，先(xian)要(yao)消(xiao)化(hua)處理(li)並進(jin)行細胞(bao)計數(shu)。消(xiao)化(hua)方法按(an)照(zhao)細胞(bao)傳(chuan)代(dai)方法步(bu)驟(zhou)進(jin)行， 重(zhong)懸液使用(yong)血清(qing)。懸浮(fu)細胞(bao)直接計(ji)數(shu)後(hou)離(li)心(xin)，用(yong)血清(qing)重(zhong)懸浮(fu)，加(jia) DMSO 至最(zui)終(zhong)濃(nong)度(du)為10%。加(jia)入(ru) DMSO 後(hou)迅速混勻，按(an)每(mei) lml 的(de)數(shu)量(liang)分(fen)配到凍存管(guan)中。本公司按(an)每(mei)個(ge)凍(dong)存管(guan)細胞(bao)數(shu)目(mu)大於(yu) 1X106個細胞(bao)凍存。

細胞(bao)接受(shou)後的(de)處理(li)：

1. 收到細胞(bao)後，請檢查(zha)是(shi)否(fou)漏液，如(ru)果漏液，請拍(pai)照(zhao)片(pian)發給(gei)我(wo)們(men)。

2. 請先(xian)在(zai)顯(xian)微(wei)鏡下(xia)確(que)認(ren)細胞(bao)生長狀(zhuang)態，去(qu)掉(diao)封(feng)口(kou)膜(mo)並將(jiang) T25瓶置於(yu) 37°C 培養約 2-3h〇

3. 棄(qi)去(qu) T25瓶中的培養基(ji)，添加(jia) 6ml 本公司附(fu)帶(dai)的培養基(ji)。

4. 如(ru)果細胞(bao)長滿（90%以上(shang)）請及(ji)時進(jin)行細胞(bao)傳(chuan)代(dai)，傳(chuan)代(dai)培養用 6ml 本公司附(fu)帶(dai)的培養基(ji)。

5. 接到細胞(bao)次(ci)日(ri)，請檢查(zha)細胞(bao)是否(fou)汙染(ran)，若發現汙染(ran)或(huo)疑似汙(wu)染，請及(ji)時與我(wo)們(men)取得聯(lian)系。

人(ren)造血幹(gan)細胞(bao)

培養方法：

收到細胞(bao)後，在(zai)倒置顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀(guan)察(cha)整(zheng)個細胞(bao)生長情(qing)況(kuang)：

如(ru)果細胞(bao)未長滿，用(yong)75%酒精(jing)噴灑整(zheng)個瓶消毒(du)後放到超菌臺內(nei)，嚴格無菌操作，打(da)開細胞(bao)培養瓶，留10ml培養液繼續(xu)培養。

如(ru)果細胞(bao)已長滿（達(da)80-90%）。即可(ke)進(jin)行傳(chuan)代(dai)，具(ju)體(ti)步驟(zhou)如(ru)下：

a，棄(qi)去(qu)培養液，用PBS洗(xi)1-2次(ci)。

b，向瓶內加(jia)入(ru)1.0-2.0ml酶液，在(zai)倒置顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀(guan)察(cha)細胞(bao)消化(hua)情(qing)況(kuang)，若細胞(bao)大部分(fen)變(bian)圓(yuan)，迅速拿(na)回(hui)操作臺(tai)，吸取(qu)酶，加(jia)含有(you)6ml 含10%血清(qing)的培養液，輕輕(qing)吹打(da)細胞(bao)。

c，加(jia)入(ru)等(deng)量(liang)的(de)的培養液，輕輕(qing)吹打(da)混勻後(hou)吸出(chu)壹(yi)半，分到新(xin)的(de)培養

d，傳(chuan)代(dai)比(bi)例(li)：1:2-1:3

對於(yu)懸浮(fu)細胞(bao)，傳(chuan)代(dai)可(ke)參考(kao)以下(xia)方法：

方法壹(yi)：收集(ji)細胞(bao)，1000RPM，常(chang)溫條件下(xia)離(li)心(xin) 5分(fen)鐘(zhong)，棄(qi)去(qu)上(shang)清(qing)液，補(bu)加(jia) l-2mL 培養液後吹句(ju)，將(jiang)細胞(bao)懸液按(an) 1: 2到 1: 5的比例分到新(xin)的(de)含 8ml 培 養基(ji)的 新(xin)皿(min)中或者瓶中。

方法二(er)：可(ke)選擇(ze)半數(shu)換(huan)液方式(shi)，棄(qi)去(qu)半數(shu)培養基(ji)後，將(jiang)剩余(yu)細胞(bao)懸起(qi)，將(jiang)細 胞懸(xuan) 液按(an) 1: 2到 1: 3的比例分到新(xin)的(de)含 8ml 培養基(ji)的新(xin)皿(min)中或者瓶中。

操作要(yao)點：

1）將(jiang)培養基(ji)在(zai)37℃水(shui)浴鍋預熱；準(zhun)備(bei)壹(yi)個15mL無菌的離(li)心(xin)管(guan)，加(jia)入(ru)8mL預熱培養基(ji)。

2）將(jiang)凍存細胞(bao)從液氮罐(guan)中(zhong)取(qu)出(chu)，快(kuai)速放入37℃水(shui)浴鍋中復(fu)溫（可(ke)準備(bei)壹(yi)潔(jie)凈的燒(shao)杯，裝(zhuang)滿37℃的(de)水(shui)，細胞(bao)凍存管(guan)取出(chu)後(hou)迅速放入燒(shao)杯內(nei)，再(zai)逐(zhu)步(bu)轉(zhuan)移(yi)到水(shui)浴鍋中）。輕輕晃(huang)動凍存管(guan)，使細胞(bao)能(neng)在(zai)1~2min內解(jie)凍(dong)，使細胞(bao)能(neng)盡(jin)快(kuai)通過易(yi)受(shou)損的(de)溫度(du)段（-5~0℃）。註(zhu)意(yi)凍(dong)存管(guan)管(guan)口不(bu)能(neng)沒入(ru)水(shui)中，避(bi)免引起(qi)汙染(ran)。

3）用75%酒精(jing)擦(ca)拭凍存管(guan)後再(zai)置於(yu)超凈臺內(nei)，將(jiang)管(guan)內細胞(bao)轉移(yi)至準(zhun)備好(hao)的(de)離(li)心(xin)管(guan)內，輕(qing)輕(qing)吹打(da)液體，使細胞(bao)均(jun)勻分(fen)散(san)，吹打(da)時(shi)避(bi)免產生氣(qi)泡。用(yong)新(xin)鮮培養基(ji)洗(xi)管(guan)壁(bi)2次(ci)，均(jun)轉移(yi)至(zhi)離(li)心(xin)管(guan)內。

4）800rpm離(li)心(xin)5min，棄(qi)上(shang)清(qing)，加(jia)入(ru)新(xin)鮮的(de)培養基(ji)，吹打(da)制(zhi)成(cheng)細胞(bao)懸液。

5）將(jiang)細胞(bao)懸液轉移(yi)至(zhi)T25細胞(bao)瓶內，補(bu)加(jia)適(shi)量(liang)的(de)培養基(ji)，輕輕(qing)晃(huang)動細胞(bao)瓶使細胞(bao)分布(bu)均(jun)勻，放入溫箱內培養。

6）隔天觀(guan)察(cha)細胞(bao)貼壁(bi)生長情(qing)況(kuang)，換新(xin)鮮培養基(ji)以去(qu)除(chu)死(si)細胞(bao)。繼續(xu)培養，待細胞(bao)長至(zhi)80~90%匯(hui)合(he)時(shi)正常(chang)傳(chuan)代(dai)。壹(yi)般剛(gang)復(fu)蘇的細胞(bao)需經過2~3次(ci)傳(chuan)代(dai)，細胞(bao)活力恢復(fu)後(hou)才(cai)能(neng)進(jin)行後(hou)續(xu)的實(shi)驗(yan)。

友情(qing)提示註(zhu)意(yi)以下(xia)幾點：

1、收到細胞(bao)後請盡(jin)快(kuai)更(geng)換為含15%血清(qing)的新(xin)鮮培養基(ji)，如(ru)因(yin)特殊(shu)情(qing)況(kuang)需要繼(ji)續(xu)使用(yong)原(yuan)瓶，請在(zai)原(yuan)瓶培養基(ji)中額外(wai)添加(jia)10%的(de)血清(qing)

2、貼壁(bi)細胞(bao)收到當天切(qie)忌立(li)刻(ke)消(xiao)化(hua)，請將(jiang)細胞(bao)換液後放置培養箱孵育(yu)到隔天(tian)再(zai)做(zuo)消化傳(chuan)代(dai)，請優先(xian)選(xuan)擇(ze)直徑6cm的培養皿進(jin)行傳(chuan)代(dai)培養

3、如(ru)簽收時(shi)出(chu)現培養瓶壁(bi)破裂(lie)，漏液等(deng)情(qing)況(kuang)請及(ji)時做好(hao)照(zhao)片(pian)記(ji)錄(lu)並聯系實驗(yan)室

細胞(bao)用途(tu)：僅供(gong)科研使用(yong)。