人(ren)真(zhen)皮(pi)毛乳(ru)頭(tou)細(xi)胞(bao)

人(ren)真(zhen)皮(pi)毛乳(ru)頭(tou)細(xi)胞(bao)

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細胞(bao)培養步(bu)驟

1) 培養基(ji)及(ji)培養凍(dong)存(cun)條件準備：

1. 準備 McCOY's 5A 培養基(ji)(McCOY's 5A，SIGMA,貨(huo)號(hao) M4892，添(tian)加 NaHC03 2.2g/L)，90%;you質(zhi)胎(tai)牛(niu)血清(qing)，10%。

2. 培養條件：氣相：空(kong)氣(qi)，95%;碳(tan)，5%。溫度(du)：37攝(she)氏度，培養箱(xiang)濕度(du)為70%-80%。

3. 凍(dong)存(cun)液：90%培養基(ji)，10%DMSO,現(xian)用現配(pei)。液氮儲存。

2) 細胞(bao)處理：

復蘇(su)細(xi)胞(bao)：將含有 lmL 細胞(bao)懸(xuan)液的(de)凍(dong)存(cun)管(guan)在(zai) 37°C 水浴中(zhong)迅速(su)搖晃(huang)解(jie)凍(dong)，加 入 4mL 培養基(ji)混(hun)合均勻。在(zai) 1000RPM 條件下離心(xin) 4分鐘，棄去上清(qing)液，補(bu) 加 l-2mL 培養基(ji)後吹勻。然後將所(suo)有細(xi)胞(bao)懸(xuan)液加入培養瓶(ping)中(zhong)培養過夜(ye)（或將(jiang) 細胞(bao)懸(xuan)液加入 l〇cm皿中(zhong)，加入約(yue) 8ml 培養基(ji)，培養過夜(ye)）。隔(ge)天換(huan)液並檢查(zha)細胞(bao)密(mi)度。

細胞(bao)凍(dong)存(cun)：

待(dai)細(xi)胞(bao)生長(chang)狀態(tai)良好時，可進行細胞(bao)凍(dong)存(cun)。貼壁(bi)細胞(bao)凍(dong)存(cun)時，先要消(xiao)化(hua)處(chu)理並進(jin)行細胞(bao)計(ji)數。消(xiao)化(hua)方(fang)法按(an)照(zhao)細(xi)胞(bao)傳代(dai)方(fang)法步(bu)驟進行， 重懸(xuan)液使(shi)用血清(qing)。懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)直接(jie)計(ji)數後離心(xin)，用(yong)血清(qing)重懸(xuan)浮，加 DMSO 至最終濃(nong)度(du)為10%。加入 DMSO 後迅速(su)混(hun)勻，按(an)每(mei) lml 的(de)數量分配到凍(dong)存(cun)管(guan)中(zhong)。本公(gong)司(si)按(an)每(mei)個(ge)凍(dong)存(cun)管(guan)細(xi)胞(bao)數目大於 1X106個細(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)。

細胞(bao)接受(shou)後的處理：

1. 收到細胞(bao)後，請檢查(zha)是否(fou)漏液，如果漏(lou)液(ye)，請拍(pai)照(zhao)片發給(gei)我(wo)們。

2. 請先在(zai)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下確認(ren)細胞(bao)生長(chang)狀態(tai)，去(qu)掉封口(kou)膜並將(jiang) T25瓶(ping)置(zhi)於 37°C 培養約(yue) 2-3h〇

3. 棄去 T25瓶(ping)中(zhong)的培養基(ji)，添(tian)加 6ml 本公(gong)司(si)附(fu)帶的培養基(ji)。

4. 如果細(xi)胞(bao)長(chang)滿(man)（90%以上）請及(ji)時(shi)進(jin)行細胞(bao)傳代(dai)，傳代(dai)培養用 6ml 本公(gong)司(si)附(fu)帶的培養基(ji)。

5. 接到細胞(bao)次(ci)日，請檢查(zha)細胞(bao)是否(fou)汙(wu)染，若(ruo)發現汙(wu)染或疑似汙(wu)染，請及(ji)時(shi)與(yu)我(wo)們取得聯系(xi)。

人(ren)真(zhen)皮(pi)毛乳(ru)頭(tou)細(xi)胞(bao)

培養方(fang)法：

收到細胞(bao)後，在倒置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下觀(guan)察(cha)整(zheng)個(ge)細胞(bao)生長(chang)情(qing)況(kuang)：

如果細(xi)胞(bao)未長(chang)滿(man)，用(yong)75%酒精(jing)噴灑整個瓶(ping)消(xiao)毒(du)後放到超菌臺內，嚴(yan)格(ge)無(wu)菌操(cao)作(zuo)，打(da)開(kai)細胞(bao)培養瓶(ping)，留(liu)10ml培養液繼(ji)續(xu)培養。

如果細(xi)胞(bao)已(yi)長(chang)滿(man)（達(da)80-90%）。即(ji)可(ke)進(jin)行傳代(dai)，具體步(bu)驟如下：

a，棄去培養液，用(yong)PBS洗1-2次(ci)。

b，向瓶(ping)內加入1.0-2.0ml酶(mei)液(ye)，在倒置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下觀(guan)察(cha)細(xi)胞(bao)消(xiao)化(hua)情(qing)況，若細(xi)胞(bao)大部(bu)分變(bian)圓，迅(xun)速(su)拿(na)回操(cao)作(zuo)臺(tai)，吸(xi)取(qu)酶(mei)，加含有6ml 含10%血清(qing)的培養液，輕(qing)輕吹打細胞(bao)。

c，加入等量的(de)的(de)培養液，輕(qing)輕吹打混(hun)勻後吸(xi)出(chu)壹半(ban)，分到新(xin)的(de)培養

d，傳代(dai)比例(li)：1:2-1:3

對於懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)，傳代(dai)可參考(kao)以下方(fang)法：

方(fang)法壹(yi)：收(shou)集(ji)細胞(bao)，1000RPM，常溫條(tiao)件下離心(xin) 5分鐘，棄去上清(qing)液，補(bu)加 l-2mL 培養液後吹句(ju)，將細胞(bao)懸(xuan)液按(an) 1: 2到 1: 5的比例(li)分到新(xin)的(de)含 8ml 培 養基(ji)的(de) 新(xin)皿(min)中(zhong)或者(zhe)瓶(ping)中(zhong)。

方(fang)法二：可選(xuan)擇半(ban)數換液方(fang)式(shi)，棄去半(ban)數培養基(ji)後，將剩余細(xi)胞(bao)懸(xuan)起(qi)，將細(xi) 胞(bao)懸(xuan) 液按(an) 1: 2到 1: 3的比例(li)分到新(xin)的(de)含 8ml 培養基(ji)的(de)新(xin)皿(min)中(zhong)或者(zhe)瓶(ping)中(zhong)。

操(cao)作(zuo)要點(dian)：

1）將培養基(ji)在(zai)37℃水浴鍋(guo)預(yu)熱；準備壹(yi)個15mL無(wu)菌的離心(xin)管(guan)，加入8mL預(yu)熱培養基(ji)。

2）將凍(dong)存(cun)細胞(bao)從液(ye)氮罐中(zhong)取出(chu)，快(kuai)速(su)放入37℃水浴鍋(guo)中(zhong)復溫（可(ke)準(zhun)備壹(yi)潔凈的(de)燒(shao)杯，裝滿37℃的水，細胞(bao)凍(dong)存(cun)管(guan)取(qu)出後迅速(su)放入燒杯內，再(zai)逐步(bu)轉(zhuan)移到水浴鍋(guo)中(zhong)）。輕輕(qing)晃(huang)動(dong)凍(dong)存(cun)管(guan)，使(shi)細胞(bao)能在(zai)1~2min內解(jie)凍(dong)，使(shi)細胞(bao)能盡(jin)快通過易(yi)受(shou)損(sun)的(de)溫度(du)段(duan)（-5~0℃）。註意(yi)凍(dong)存(cun)管(guan)管(guan)口(kou)不能沒(mei)入水中(zhong)，避免(mian)引(yin)起(qi)汙(wu)染。

3）用75%酒(jiu)精擦(ca)拭凍(dong)存(cun)管(guan)後再置(zhi)於超凈(jing)臺內，將(jiang)管(guan)內細(xi)胞(bao)轉(zhuan)移至準備好的離心(xin)管(guan)內，輕(qing)輕(qing)吹打液體，使(shi)細胞(bao)均勻分散，吹打時避(bi)免產(chan)生氣(qi)泡。用新(xin)鮮(xian)培養基(ji)洗(xi)管(guan)壁(bi)2次(ci)，均轉(zhuan)移至離心(xin)管(guan)內。

4）800rpm離心(xin)5min，棄上清(qing)，加入新(xin)鮮(xian)的(de)培養基(ji)，吹打制成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液。

5）將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液轉(zhuan)移至T25細胞(bao)瓶(ping)內，補(bu)加適量的(de)培養基(ji)，輕(qing)輕晃(huang)動(dong)細胞(bao)瓶(ping)使(shi)細胞(bao)分布(bu)均勻，放入溫箱(xiang)內培養。

6）隔(ge)天觀(guan)察細(xi)胞(bao)貼壁(bi)生長(chang)情(qing)況(kuang)，換(huan)新(xin)鮮(xian)培養基(ji)以去除(chu)死(si)細胞(bao)。繼續(xu)培養，待(dai)細(xi)胞(bao)長(chang)至80~90%匯合時(shi)正(zheng)常傳(chuan)代。壹般剛(gang)復蘇(su)的(de)細(xi)胞(bao)需(xu)經過(guo)2~3次(ci)傳代(dai)，細胞(bao)活力(li)恢復(fu)後才能進行後續(xu)的實驗。

友(you)情提(ti)示(shi)註意(yi)以下幾(ji)點(dian)：

1、收到細胞(bao)後請盡(jin)快(kuai)更(geng)換(huan)為(wei)含15%血清(qing)的新(xin)鮮(xian)培養基(ji)，如因特殊情(qing)況(kuang)需(xu)要繼續(xu)使(shi)用原(yuan)瓶(ping)，請在(zai)原(yuan)瓶(ping)培養基(ji)中(zhong)額外添(tian)加10%的血清(qing)

2、貼壁(bi)細胞(bao)收到當天切(qie)忌立刻(ke)消(xiao)化(hua)，請將(jiang)細(xi)胞(bao)換液(ye)後放置(zhi)培養箱(xiang)孵育(yu)到隔(ge)天再(zai)做消(xiao)化(hua)傳(chuan)代，請優(you)先選(xuan)擇直(zhi)徑(jing)6cm的培養皿進(jin)行傳代(dai)培養

3、如簽收(shou)時(shi)出現培養瓶(ping)壁破(po)裂，漏液(ye)等情(qing)況(kuang)請及(ji)時(shi)做(zuo)好照(zhao)片記錄並聯系(xi)實驗室(shi)

細胞(bao)用途：僅(jin)供科(ke)研使(shi)用。