人(ren)直(zhi)腸成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)

人(ren)直(zhi)腸成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)

我司(si)產(chan)品(pin)齊(qi)全(quan)，因上架數量有限，未(wei)能(neng)全部(bu)上(shang)架(jia)，如需(xu)訂購或(huo)者(zhe)產(chan)品(pin)詳(xiang)情(qing)請直接聯系(xi)我司(si)銷(xiao)售(shou)！

細胞(bao)培養(yang)步(bu)驟(zhou)

1) 培(pei)養(yang)基(ji)及(ji)培養(yang)凍(dong)存(cun)條(tiao)件(jian)準備：

1. 準備 McCOY's 5A 培(pei)養(yang)基(ji)(McCOY's 5A，SIGMA,貨號(hao) M4892，添加(jia) NaHC03 2.2g/L)，90%;you質胎牛血清(qing)，10%。

2. 培(pei)養(yang)條(tiao)件(jian)：氣(qi)相(xiang)：空氣(qi)，95%;碳(tan)，5%。溫(wen)度：37攝(she)氏(shi)度，培(pei)養(yang)箱(xiang)濕(shi)度為70%-80%。

3. 凍(dong)存液(ye)：90%培養(yang)基(ji)，10%DMSO,現用(yong)現配(pei)。液(ye)氮儲(chu)存。

2) 細胞(bao)處理(li)：

復(fu)蘇細胞(bao)：將(jiang)含(han)有(you) lmL 細胞(bao)懸(xuan)液(ye)的(de)凍(dong)存(cun)管(guan)在(zai) 37°C 水浴中迅速(su)搖晃解凍(dong)，加(jia) 入 4mL 培養(yang)基(ji)混合(he)均(jun)勻。在(zai) 1000RPM 條(tiao)件(jian)下(xia)離心(xin) 4分鐘，棄去上(shang)清(qing)液(ye)，補 加(jia) l-2mL 培養(yang)基(ji)後吹(chui)勻。然後將(jiang)所有(you)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)加(jia)入培養(yang)瓶(ping)中培(pei)養(yang)過(guo)夜（或(huo)將(jiang) 細胞(bao)懸(xuan)液(ye)加(jia)入 l〇cm皿中，加(jia)入約 8ml 培(pei)養(yang)基(ji)，培養(yang)過(guo)夜）。隔(ge)天(tian)換(huan)液(ye)並檢(jian)查(zha)細胞(bao)密度。

細胞(bao)凍存(cun)：

待(dai)細胞(bao)生長(chang)狀態(tai)良(liang)好(hao)時，可進(jin)行細胞(bao)凍存(cun)。貼壁(bi)細胞(bao)凍存(cun)時(shi)，先要消化處理並進(jin)行細胞(bao)計數(shu)。消化方法(fa)按照(zhao)細胞(bao)傳代(dai)方法(fa)步(bu)驟(zhou)進(jin)行， 重(zhong)懸(xuan)液(ye)使用(yong)血清(qing)。懸(xuan)浮細胞(bao)直接(jie)計(ji)數後離心(xin)，用(yong)血清(qing)重(zhong)懸(xuan)浮，加(jia) DMSO 至(zhi)最(zui)終濃度為10%。加(jia)入 DMSO 後迅速(su)混(hun)勻，按每 lml 的(de)數(shu)量分配到凍(dong)存管(guan)中。本(ben)公(gong)司(si)按(an)每個凍存管(guan)細胞(bao)數目(mu)大(da)於 1X106個細胞(bao)凍存(cun)。

細胞(bao)接受(shou)後的(de)處(chu)理(li)：

1. 收(shou)到細胞(bao)後，請(qing)檢(jian)查(zha)是否(fou)漏液(ye)，如果(guo)漏液(ye)，請拍照片發給(gei)我們。

2. 請(qing)先在(zai)顯(xian)微(wei)鏡下(xia)確認(ren)細胞(bao)生長(chang)狀態(tai)，去掉(diao)封口膜並將(jiang) T25瓶置於(yu) 37°C 培養(yang)約 2-3h〇

3. 棄去 T25瓶(ping)中的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，添加(jia) 6ml 本(ben)公(gong)司(si)附(fu)帶的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。

4. 如(ru)果細胞(bao)長滿（90%以(yi)上(shang)）請及(ji)時進(jin)行細胞(bao)傳代(dai)，傳代(dai)培養(yang)用(yong) 6ml 本(ben)公(gong)司(si)附(fu)帶的(de)培(pei)養(yang)基(ji)。

5. 接(jie)到細胞(bao)次日，請檢(jian)查(zha)細胞(bao)是否(fou)汙(wu)染(ran)，若(ruo)發現汙(wu)染(ran)或(huo)疑(yi)似(si)汙染(ran)，請(qing)及(ji)時與(yu)我們取(qu)得(de)聯系(xi)。

人(ren)直(zhi)腸成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)

培(pei)養(yang)方(fang)法(fa)：

收(shou)到細胞(bao)後，在(zai)倒置顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀察整(zheng)個細胞(bao)生長(chang)情(qing)況(kuang)：

如(ru)果細胞(bao)未(wei)長(chang)滿，用(yong)75%酒精(jing)噴灑整(zheng)個瓶消毒(du)後放到超(chao)菌(jun)臺內(nei)，嚴格無菌(jun)操(cao)作(zuo)，打(da)開細胞(bao)培養(yang)瓶(ping)，留(liu)10ml培(pei)養(yang)液(ye)繼續(xu)培養(yang)。

如(ru)果細胞(bao)已長滿（達(da)80-90%）。即(ji)可進(jin)行傳代(dai)，具體步(bu)驟(zhou)如(ru)下(xia)：

a，棄去培(pei)養(yang)液(ye)，用(yong)PBS洗1-2次。

b，向(xiang)瓶內(nei)加(jia)入1.0-2.0ml酶液(ye)，在(zai)倒置顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀察細胞(bao)消化情況(kuang)，若細胞(bao)大(da)部分變(bian)圓，迅速(su)拿回操作(zuo)臺，吸取(qu)酶，加(jia)含(han)有(you)6ml 含(han)10%血(xue)清(qing)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)，輕輕(qing)吹打細胞(bao)。

c，加(jia)入等量的(de)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)，輕輕(qing)吹打混勻後吸出(chu)壹(yi)半(ban)，分到新(xin)的(de)培(pei)養(yang)

d，傳代(dai)比例(li)：1:2-1:3

對(dui)於懸(xuan)浮細胞(bao)，傳代(dai)可參考以(yi)下(xia)方法(fa)：

方(fang)法(fa)壹：收(shou)集細胞(bao)，1000RPM，常溫(wen)條(tiao)件(jian)下(xia)離心(xin) 5分鐘，棄去上(shang)清(qing)液(ye)，補加(jia) l-2mL 培養(yang)液(ye)後吹(chui)句(ju)，將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)按 1: 2到 1: 5的(de)比(bi)例(li)分到新(xin)的(de)含(han) 8ml 培(pei) 養(yang)基(ji)的(de) 新(xin)皿中或(huo)者(zhe)瓶中。

方(fang)法(fa)二：可選擇(ze)半(ban)數換(huan)液(ye)方式(shi)，棄去半(ban)數培(pei)養(yang)基(ji)後，將(jiang)剩(sheng)余(yu)細胞(bao)懸(xuan)起，將(jiang)細 胞(bao)懸(xuan) 液(ye)按 1: 2到 1: 3的(de)比(bi)例(li)分到新(xin)的(de)含(han) 8ml 培(pei)養(yang)基(ji)的(de)新(xin)皿中或(huo)者(zhe)瓶中。

操(cao)作(zuo)要(yao)點：

1）將(jiang)培養(yang)基(ji)在(zai)37℃水浴鍋預熱(re)；準備壹(yi)個15mL無菌(jun)的(de)離心(xin)管(guan)，加(jia)入8mL預熱(re)培養(yang)基(ji)。

2）將(jiang)凍存(cun)細胞(bao)從液(ye)氮罐(guan)中取(qu)出，快速放入37℃水浴鍋中復(fu)溫(wen)（可準備壹(yi)潔(jie)凈的(de)燒(shao)杯，裝(zhuang)滿37℃的(de)水，細胞(bao)凍存(cun)管(guan)取(qu)出後迅速(su)放入燒(shao)杯內，再(zai)逐(zhu)步(bu)轉(zhuan)移到水浴鍋中）。輕(qing)輕(qing)晃動凍(dong)存(cun)管(guan)，使(shi)細胞(bao)能(neng)在(zai)1~2min內解凍(dong)，使(shi)細胞(bao)能(neng)盡(jin)快通(tong)過(guo)易(yi)受損(sun)的(de)溫(wen)度段(duan)（-5~0℃）。註(zhu)意(yi)凍(dong)存管(guan)管(guan)口不能(neng)沒入水中，避(bi)免引(yin)起汙染(ran)。

3）用(yong)75%酒精(jing)擦拭凍(dong)存(cun)管(guan)後再(zai)置於(yu)超凈(jing)臺內(nei)，將(jiang)管(guan)內(nei)細胞(bao)轉(zhuan)移至(zhi)準備好(hao)的(de)離心(xin)管(guan)內(nei)，輕輕吹打(da)液(ye)體，使(shi)細胞(bao)均(jun)勻分散，吹打(da)時(shi)避(bi)免產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao)。用(yong)新(xin)鮮培(pei)養(yang)基(ji)洗管(guan)壁(bi)2次，均(jun)轉(zhuan)移至(zhi)離心(xin)管(guan)內(nei)。

4）800rpm離心(xin)5min，棄上(shang)清(qing)，加(jia)入新(xin)鮮的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，吹打(da)制(zhi)成(cheng)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)。

5）將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液(ye)轉(zhuan)移至(zhi)T25細胞(bao)瓶內(nei)，補加(jia)適(shi)量的(de)培(pei)養(yang)基(ji)，輕輕(qing)晃動細胞(bao)瓶使(shi)細胞(bao)分布均(jun)勻，放入溫(wen)箱(xiang)內培(pei)養(yang)。

6）隔(ge)天(tian)觀察細胞(bao)貼壁(bi)生長情(qing)況(kuang)，換(huan)新(xin)鮮培(pei)養(yang)基(ji)以去除(chu)死(si)細胞(bao)。繼續(xu)培養(yang)，待(dai)細胞(bao)長至(zhi)80~90%匯合(he)時(shi)正(zheng)常傳代(dai)。壹般(ban)剛(gang)復(fu)蘇的(de)細胞(bao)需(xu)經(jing)過2~3次傳代(dai)，細胞(bao)活(huo)力(li)恢復(fu)後才(cai)能(neng)進(jin)行後續(xu)的(de)實(shi)驗。

友情(qing)提(ti)示(shi)註(zhu)意(yi)以(yi)下(xia)幾點：

1、收(shou)到細胞(bao)後請(qing)盡(jin)快更(geng)換(huan)為含(han)15%血(xue)清(qing)的(de)新(xin)鮮培(pei)養(yang)基(ji)，如因(yin)特(te)殊情(qing)況(kuang)需(xu)要繼續(xu)使用(yong)原瓶，請在(zai)原瓶培養(yang)基(ji)中額(e)外(wai)添(tian)加(jia)10%的(de)血(xue)清(qing)

2、貼壁(bi)細胞(bao)收到當(dang)天切(qie)忌(ji)立(li)刻(ke)消化，請將(jiang)細胞(bao)換(huan)液(ye)後放置培(pei)養(yang)箱(xiang)孵育(yu)到隔(ge)天再(zai)做(zuo)消化傳代(dai)，請優(you)先(xian)選擇(ze)直(zhi)徑(jing)6cm的(de)培(pei)養(yang)皿(min)進(jin)行傳代(dai)培養(yang)

3、如(ru)簽(qian)收(shou)時(shi)出現培(pei)養(yang)瓶(ping)壁(bi)破裂，漏液(ye)等情(qing)況(kuang)請及(ji)時做(zuo)好(hao)照片(pian)記(ji)錄並聯系實(shi)驗室(shi)

細胞(bao)用(yong)途：僅(jin)供(gong)科(ke)研(yan)使用(yong)。