人子宮(gong)內(nei)膜上皮細胞

人子宮(gong)內(nei)膜上皮細胞

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細胞培養步驟

1) 培(pei)養基及(ji)培養凍存條(tiao)件準(zhun)備：

1. 準(zhun)備 McCOY's 5A 培(pei)養基(McCOY's 5A，SIGMA,貨(huo)號(hao) M4892，添加(jia) NaHC03 2.2g/L)，90%;you質(zhi)胎(tai)牛血清，10%。

2. 培(pei)養條(tiao)件：氣相：空(kong)氣，95%;碳，5%。溫(wen)度：37攝(she)氏(shi)度，培(pei)養箱(xiang)濕度為(wei)70%-80%。

3. 凍(dong)存液(ye)：90%培(pei)養基，10%DMSO,現(xian)用現(xian)配。液氮(dan)儲(chu)存。

2) 細胞處理(li)：

復蘇細胞：將含(han)有(you) lmL 細胞懸液(ye)的(de)凍存管(guan)在 37°C 水(shui)浴(yu)中(zhong)迅速(su)搖晃(huang)解凍，加(jia) 入 4mL 培養基混合均(jun)勻。在 1000RPM 條(tiao)件下離心 4分鐘，棄(qi)去上清液(ye)，補(bu) 加 l-2mL 培(pei)養基後(hou)吹(chui)勻(yun)。然(ran)後(hou)將所(suo)有(you)細胞懸液(ye)加入(ru)培(pei)養瓶(ping)中(zhong)培養過夜(ye)（或(huo)將 細胞懸液(ye)加入(ru) l〇cm皿(min)中(zhong)，加入(ru)約 8ml 培(pei)養基，培(pei)養過夜(ye)）。隔天換液(ye)並檢(jian)查細胞密度。

細胞凍存：

待(dai)細胞生(sheng)長狀態(tai)良好時，可進行細胞凍存。貼(tie)壁(bi)細胞凍存時，先(xian)要消化(hua)處理(li)並進(jin)行細胞計數。消化(hua)方法(fa)按(an)照(zhao)細胞傳代(dai)方法(fa)步驟進(jin)行， 重(zhong)懸液(ye)使(shi)用血清。懸(xuan)浮細胞直接(jie)計(ji)數後(hou)離心，用血清重(zhong)懸浮，加 DMSO 至最(zui)終(zhong)濃(nong)度為(wei)10%。加入 DMSO 後(hou)迅(xun)速(su)混勻，按每(mei) lml 的(de)數量(liang)分配到凍存管(guan)中(zhong)。本(ben)公(gong)司按每(mei)個凍(dong)存管(guan)細胞數目大(da)於(yu) 1X106個細胞凍存。

細胞接(jie)受(shou)後(hou)的(de)處理(li)：

1. 收到細胞後(hou)，請(qing)檢(jian)查是否漏(lou)液，如果(guo)漏(lou)液，請(qing)拍照(zhao)片(pian)發給(gei)我(wo)們。

2. 請(qing)先(xian)在顯(xian)微鏡(jing)下(xia)確認細胞生(sheng)長狀態(tai)，去掉(diao)封口(kou)膜並將 T25瓶(ping)置(zhi)於(yu) 37°C 培(pei)養約 2-3h〇

3. 棄(qi)去 T25瓶(ping)中(zhong)的(de)培養基，添(tian)加 6ml 本(ben)公(gong)司附(fu)帶的(de)培養基。

4. 如果(guo)細胞長滿(man)（90%以(yi)上(shang)）請(qing)及(ji)時進行細胞傳代(dai)，傳代(dai)培養用 6ml 本(ben)公(gong)司附(fu)帶的(de)培養基。

5. 接(jie)到(dao)細胞次日，請(qing)檢(jian)查細胞是否汙染(ran)，若(ruo)發現(xian)汙(wu)染(ran)或(huo)疑(yi)似汙染(ran)，請(qing)及(ji)時與(yu)我(wo)們取得(de)聯(lian)系。

人子宮(gong)內(nei)膜上皮細胞

培(pei)養方法：

收到細胞後(hou)，在倒(dao)置(zhi)顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀察整(zheng)個細胞生(sheng)長情(qing)況：

如果(guo)細胞未(wei)長滿(man)，用75%酒(jiu)精噴(pen)灑(sa)整(zheng)個瓶(ping)消毒後(hou)放(fang)到(dao)超菌(jun)臺(tai)內，嚴(yan)格(ge)無(wu)菌(jun)操(cao)作，打(da)開(kai)細胞培養瓶(ping)，留10ml培(pei)養液繼(ji)續(xu)培(pei)養。

如果(guo)細胞已(yi)長滿(man)（達(da)80-90%）。即(ji)可進(jin)行傳(chuan)代(dai)，具(ju)體(ti)步驟如下：

a，棄(qi)去培養液，用PBS洗1-2次。

b，向(xiang)瓶(ping)內加入1.0-2.0ml酶液，在倒(dao)置(zhi)顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀察細胞消化(hua)情況，若(ruo)細胞大部分變圓(yuan)，迅(xun)速(su)拿(na)回(hui)操(cao)作臺(tai)，吸(xi)取酶，加含(han)有(you)6ml 含(han)10%血清的(de)培養液，輕(qing)輕(qing)吹打(da)細胞。

c，加(jia)入等(deng)量(liang)的(de)的(de)培養液，輕(qing)輕(qing)吹打(da)混勻後(hou)吸(xi)出(chu)壹(yi)半，分到新(xin)的(de)培養

d，傳(chuan)代(dai)比例(li)：1:2-1:3

對(dui)於(yu)懸(xuan)浮細胞，傳(chuan)代(dai)可參(can)考(kao)以(yi)下方法：

方(fang)法壹(yi)：收集細胞，1000RPM，常(chang)溫條(tiao)件下離心 5分鐘，棄(qi)去上清液(ye)，補(bu)加 l-2mL 培(pei)養液後(hou)吹(chui)句(ju)，將細胞懸液(ye)按 1: 2到(dao) 1: 5的(de)比例(li)分到新(xin)的(de)含(han) 8ml 培 養基的(de) 新(xin)皿(min)中(zhong)或(huo)者(zhe)瓶(ping)中(zhong)。

方(fang)法二：可選擇(ze)半數換液(ye)方(fang)式，棄(qi)去半數培(pei)養基後(hou)，將剩(sheng)余(yu)細胞懸起(qi)，將細 胞懸 液(ye)按 1: 2到(dao) 1: 3的(de)比例(li)分到新(xin)的(de)含(han) 8ml 培養基的(de)新(xin)皿(min)中(zhong)或(huo)者(zhe)瓶(ping)中(zhong)。

操(cao)作要(yao)點：

1）將培養基在37℃水(shui)浴(yu)鍋預熱；準(zhun)備壹(yi)個15mL無(wu)菌(jun)的(de)離心管，加入8mL預熱培(pei)養基。

2）將凍存細胞從液(ye)氮(dan)罐中(zhong)取出，快(kuai)速(su)放(fang)入(ru)37℃水浴鍋中(zhong)復溫（可準(zhun)備壹(yi)潔(jie)凈(jing)的(de)燒杯(bei)，裝滿(man)37℃的(de)水，細胞凍存管(guan)取出後(hou)迅(xun)速(su)放入(ru)燒杯內(nei)，再(zai)逐(zhu)步轉(zhuan)移到水浴(yu)鍋中(zhong)）。輕(qing)輕(qing)晃(huang)動(dong)凍存管(guan)，使(shi)細胞能在1~2min內(nei)解凍，使(shi)細胞能盡(jin)快(kuai)通過易受(shou)損(sun)的(de)溫度段(duan)（-5~0℃）。註意凍存管(guan)管(guan)口不(bu)能沒入水中(zhong)，避免(mian)引起汙染(ran)。

3）用75%酒精擦(ca)拭凍存管(guan)後(hou)再(zai)置(zhi)於(yu)超(chao)凈(jing)臺(tai)內，將管內(nei)細胞轉(zhuan)移至準(zhun)備好的(de)離心管內，輕(qing)輕(qing)吹打(da)液體，使(shi)細胞均(jun)勻分散(san)，吹打時避免(mian)產生(sheng)氣泡。用新(xin)鮮培養基洗(xi)管壁(bi)2次，均(jun)轉(zhuan)移至離心管內。

4）800rpm離心5min，棄上清，加(jia)入(ru)新(xin)鮮的(de)培養基，吹(chui)打制成(cheng)細胞懸液(ye)。

5）將細胞懸液(ye)轉(zhuan)移至T25細胞瓶(ping)內，補(bu)加適(shi)量(liang)的(de)培養基，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動(dong)細胞瓶(ping)使(shi)細胞分布均(jun)勻，放(fang)入(ru)溫(wen)箱(xiang)內(nei)培(pei)養。

6）隔天(tian)觀察細胞貼壁(bi)生(sheng)長情(qing)況，換新(xin)鮮培養基以(yi)去除死細胞。繼(ji)續(xu)培(pei)養，待細胞長至80~90%匯(hui)合時正常傳(chuan)代(dai)。壹般(ban)剛復蘇的(de)細胞需經(jing)過2~3次傳(chuan)代(dai)，細胞活(huo)力(li)恢復後(hou)才能進(jin)行後(hou)續(xu)的(de)實驗。

友(you)情提示註意以下幾點：

1、收到細胞後(hou)請(qing)盡(jin)快(kuai)更(geng)換為(wei)含(han)15%血清的(de)新(xin)鮮培養基，如因(yin)特殊(shu)情況需要繼(ji)續(xu)使(shi)用原瓶(ping)，請(qing)在原(yuan)瓶(ping)培養基中(zhong)額(e)外(wai)添加(jia)10%的(de)血清

2、貼(tie)壁細胞收到當(dang)天切(qie)忌立刻(ke)消化(hua)，請(qing)將細胞換液(ye)後(hou)放(fang)置(zhi)培養箱(xiang)孵育到(dao)隔天再(zai)做(zuo)消化(hua)傳代(dai)，請(qing)優(you)先(xian)選擇(ze)直徑(jing)6cm的(de)培養皿(min)進行傳(chuan)代(dai)培養

3、如簽收時出現(xian)培(pei)養瓶(ping)壁破裂(lie)，漏(lou)液等(deng)情況請(qing)及(ji)時做(zuo)好照(zhao)片(pian)記錄(lu)並聯(lian)系實(shi)驗室

細胞用途(tu)：僅(jin)供科(ke)研使(shi)用。