大(da)鼠丙(bing)酮酸脫氫酶(mei)(PDH)elisa試劑(ji)盒(he)

大(da)鼠丙(bing)酮酸脫氫酶(mei)(PDH)elisa試劑(ji)盒(he)

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檢(jian)測原(yuan)理

試劑(ji)盒(he)采用(yong)雙抗(kang)原(yuan)壹-步夾心法酶(mei)聯(lian)免疫吸附(fu)試驗(ELISA) 。往(wang)預先(xian)包(bao)被(bei)病毒(du)抗(kang)ti的包(bao)被(bei)微孔中，依次(ci)加(jia)入標本、HRP標記(ji)的檢測抗(kang)原(yuan)，經(jing)過(guo)溫(wen)育(yu)並徹di洗(xi)滌(di)。用(yong)底物TMB顯(xian)色，TMB在(zai)過(guo)氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在(zai)suan的作(zuo)用(yong)下轉化成最終的黃色。用(yong)酶標儀在(zai)450NM波(bo)長(chang)下測定吸光度(OD值(zhi)) ，與CUTOFF值(zhi)相比較，從而(er)判(pan)定標本中豬病毒(du)(BVDV) 的存在(zai)與否。

樣(yang)品收集、處(chu)理及(ji)保存方法

1.血清:使用(yong)不含(han)熱原(yuan)和(he)內(nei)毒素(su)的試管，操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中避(bi)免任何細(xi)胞(bao)刺激(ji)，收集血液(ye)後(hou)，3000轉(zhuan)離心10分鐘(zhong)將(jiang)血清和(he)紅(hong)細胞(bao)迅(xun)速(su)小(xiao)心地(di)分離。

2.血漿(jiang): EDTA、檸(ning)檬suan鹽(yan)或肝素(su)抗(kang)凝(ning)。3000轉(zhuan)離心30分鐘(zhong)取上清。

3.細(xi)胞上(shang)清液(ye): 3000轉(zhuan)離心10分鐘(zhong)去除(chu)顆(ke)粒和(he)聚合物。

4.組(zu)織勻(yun)漿(jiang):將(jiang)組織(zhi)加(jia)入適量生理鹽水(shui)搗(dao)碎(sui)。3000轉(zhuan) 離心10分鐘(zhong)取上清。

5.保存:如(ru)果(guo)樣(yang)本收集後不(bu)及(ji)時檢測(ce)，請按壹(yi)次(ci)用(yong)量分裝，凍存於-20°C， 避(bi)免反

復凍(dong)融(rong)，在(zai)室(shi)溫(wen)下解(jie)凍(dong)並確(que)保樣(yang)品均勻地(di)充分解(jie)凍(dong)。

自備(bei)物品

1.酶(mei)標儀(450NM)

2.高(gao)精度加(jia)樣(yang)器及(ji)槍頭(tou): 0.5-10UL、 2-20UL、 20-200UL、 200-1000UL

3.37℃恒(heng)溫(wen)箱(xiang)

操(cao)作(zuo)註(zhu)意(yi)事(shi)項

1.試劑(ji)盒(he)保存在(zai)2-8°C，使用(yong)前室(shi)溫(wen)平(ping)衡20分鐘(zhong)。從冰(bing)箱(xiang)取出的濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)會有結(jie)晶(jing)，這屬(shu)於正常現(xian)象(xiang)，水(shui)浴(yu)加(jia)熱使結晶(jing)完(wan)quan溶(rong)解(jie)後(hou)再使用(yong)。

2.實(shi)驗中不用(yong)的板條應(ying)立即放(fang)回自封袋中，密(mi)封(低(di)溫(wen)幹燥)保存。

3.預處(chu)理後的樣(yang)本請按照操(cao)作(zuo)步驟(zhou)用(yong)樣(yang)ben稀(xi)釋ye適(shi)當(dang)稀釋以達(da)到(dao)試劑(ji)盒(he)的檢測效(xiao)果(guo)。.

4.嚴(yan)格按照說(shuo)明(ming)書中標明的時間(jian)、加(jia)液(ye)量(liang)及(ji)順(shun)序(xu)進行(xing)溫(wen)育(yu)操(cao)作(zuo)。

5.所(suo)有液(ye)體組(zu)分使用(yong)前充分搖勻(yun)。

大(da)鼠丙(bing)酮酸脫氫酶(mei)(PDH)elisa試劑(ji)盒(he)

常(chang)用(yong)方法：

1. 夾心法：

夾心法常(chang)用(yong)於檢測大(da)分子抗(kang)原(yuan)，壹般的操作(zuo)步驟(zhou)為:

a. 將(jiang)具(ju)有專(zhuan)壹(yi)性的抗(kang)ti固著(zhu)（coating）於塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)，完(wan)成後洗(xi)去(qu)多余(yu)抗(kang)ti

b. 加(jia)入待測檢(jian)體，檢(jian)體中若含(han)有待(dai)測(ce)的抗(kang)原(yuan)，則其會與塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)的抗(kang)ti進行(xing)專(zhuan)壹(yi)性鍵結

c. 洗(xi)去(qu)多余(yu)待(dai)測檢(jian)體，加(jia)入另壹種對(dui)抗(kang)原(yuan)專(zhuan)壹(yi)的壹次(ci)抗(kang)ti，與待測抗(kang)原(yuan)進行(xing)鍵結

d. 洗(xi)去(qu)多余(yu)未(wei)鍵結壹(yi)次(ci)抗(kang)ti，加(jia)入帶有酶(mei)的二次(ci)抗(kang)ti，與壹次(ci)抗(kang)ti鍵結

e. 洗(xi)去(qu)多余(yu)未(wei)鍵結二(er)次(ci)抗(kang)ti，加(jia)入酶底物使酵素(su)呈(cheng)色(se)，以肉(rou)眼(yan)或儀器(qi)讀(du)取呈(cheng)色(se)結果(guo)

原(yuan)理：針(zhen)對(dui)抗(kang)原(yuan)分子上2個不同抗(kang)原(yuan)決(jue)定簇(cu)的單克(ke)隆抗(kang)ti分別(bie)作(zuo)為固相抗(kang)ti和(he)酶(mei)標抗(kang)ti，將(jiang)大(da)分子抗(kang)原(yuan)分別(bie)制備(bei)固相抗(kang)原(yuan)和(he)酶(mei)標抗(kang)原(yuan)結合物。

2. 間(jian)接(jie)法

間(jian)接(jie)法常(chang)用(yong)於檢測抗(kang)ti，壹(yi)般的操作(zuo)步驟(zhou)為：

a. 將(jiang)已(yi)知(zhi)的抗(kang)原(yuan)固著(zhu)於塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)，完(wan)成後洗(xi)去(qu)多余(yu)的抗(kang)原(yuan)。

b. 加(jia)入待測檢(jian)體，檢(jian)體中若含(han)有待(dai)測(ce)的壹次(ci)抗(kang)ti，則(ze)其會與塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)的抗(kang)原(yuan)進行(xing)專(zhuan)壹(yi)性鍵結。

c. 洗(xi)去(qu)多余(yu)待(dai)測檢(jian)體，加(jia)入帶有酶(mei)的二次(ci)抗(kang)ti，與待測的壹次(ci)抗(kang)ti鍵結。

d. 洗(xi)去(qu)多余(yu)未(wei)鍵結二(er)次(ci)抗(kang)ti，加(jia)入酶底物使酶呈(cheng)色(se)，藉儀器(qi)（ELISA reader）測(ce)定塑(su)膠盤(pan)中的吸光值(zhi)（OD值(zhi)），以評(ping)估(gu)有色(se)終(zhong)產物的含量即可(ke)測(ce)量待測抗(kang)ti的含量。

原(yuan)理：利用(yong)酶標記(ji)的抗(kang)抗(kang)ti以(yi)檢測(ce)已(yi)與固相結合的受檢抗(kang)ti。

3. 競爭(zheng)法

競爭(zheng)法是壹種較少(shao)用(yong)到(dao)的ELISA檢(jian)測機制，壹般用(yong)於檢測小(xiao)分子抗(kang)原(yuan)，其操作(zuo)步驟(zhou)為：

a. 將(jiang)具(ju)有專(zhuan)壹(yi)性的抗(kang)ti固著(zhu)於塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)，完(wan)成後洗(xi)去(qu)多余(yu)抗(kang)ti

b. 加(jia)入待測檢(jian)體，使檢體中的待測抗(kang)原(yuan)與塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)的抗(kang)ti進行(xing)專(zhuan)壹(yi)性鍵結

c. 加(jia)入帶有酶(mei)的抗(kang)原(yuan)，此(ci)抗(kang)原(yuan)也可(ke)與塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)的抗(kang)ti進行(xing)專(zhuan)壹(yi)性鍵結，由(you)於塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)固著(zhu)的抗(kang)ti數(shu)量有限，因此(ci)當(dang)檢體中抗(kang)原(yuan)的量越多，則(ze)帶有酶(mei)的抗(kang)原(yuan)可(ke)鍵結的固著(zhu)抗(kang)ti就(jiu)越少(shao)，亦(yi)即，兩(liang)種抗(kang)原(yuan)皆競相與塑(su)膠孔(kong)盤上(shang)抗(kang)ti鍵結，即所謂(wei)競爭(zheng)法之由(you)來(lai)。

d. 洗(xi)去(qu)檢體與帶有酶(mei)的抗(kang)原(yuan)，加(jia)入酶底物使酶呈(cheng)色(se)，當(dang)檢體中抗(kang)原(yuan)量越(yue)多，代(dai)表(biao)塑(su)膠孔(kong)盤內(nei)留下之帶有酶(mei)的抗(kang)原(yuan)越少(shao)，顯(xian)色也就(jiu)越(yue)淺(qian)。

e. 當(dang)需要偵測(ce)無法獲(huo)得兩(liang)種以(yi)上單(dan)壹性抗(kang)ti的抗(kang)原(yuan)，或是不易(yi)得到(dao)足夠的純化抗(kang)ti以(yi)固著(zhu)於孔盤上(shang)時(shi)，壹般會考慮使用(yong)競爭(zheng)法ELISA。

免責聲(sheng)明：

1. 試劑(ji)盒(he)僅供研究使用(yong)，不得用(yong)於臨(lin)床(chuang)實(shi)驗或人(ren)體實(shi)驗，否則所(suo)產生的壹切(qie)後(hou)果(guo)，由(you)實(shi)驗者(zhe)承(cheng)擔(dan)，本(ben)公(gong)司概不(bu)負(fu)責。

2. 嚴(yan)格按照說(shuo)明(ming)書操(cao)作(zuo)，實(shi)驗者(zhe)違(wei)反(fan)說明書操(cao)作(zuo)，後(hou)果(guo)由(you)實(shi)驗者(zhe)承(cheng)擔(dan)。

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