人臍(qi)帶(dai)單(dan)核細(xi)胞

人臍(qi)帶(dai)單(dan)核細(xi)胞需要準備(bei)好(hao)細(xi)胞所(suo)要用(yong)到的培養(yang)基和相(xiang)關(guan)試(shi)劑(ji)，雖然所(suo)有(you)的貼(tie)壁，半(ban)貼(tie)壁或者懸(xuan)浮細(xi)胞處(chu)理方(fang)式(shi)差(cha)不多(duo)，但是(shi)不同(tong)的實驗(yan)室培養(yang)條(tiao)件和處(chu)理力度(du)還(hai)有試(shi)劑(ji)的批(pi)間差(cha)這些問(wen)題存在(zai)，也會(hui)導致對細(xi)胞處(chu)理不(bu)當，  或者(zhe)環(huan)境的不適應而(er)造成(cheng)細(xi)胞的死(si)亡。
人臍(qi)帶(dai)單(dan)核細(xi)胞培養(yang)物的生理環(huan)境不(bu)同(tong)時(shi)定(ding)義(yi)為(wei)其物理(li)化(hua)學環(huan)境中(zhong)，更好(hao)地理解血清的組(zu)件，所(suo)必(bi)需的增殖(zhi)的生長因(yin)子的鑒定(ding)，並(bing)更好(hao)地理(li)解細(xi)胞在(zai)培養(yang)的微環(huan)境（即(ji)，細(xi)胞 - 細(xi)胞相互(hu)作(zuo)用(yong)，氣(qi)體(ti)的擴散，與基質(zhi)相互(hu)作(zuo)用(yong)）現(xian)在(zai)允許(xu)在(zai)無血清培養(yang)基中某些細(xi)胞系(xi)的培養(yang)。
培養(yang)物的主(zhu)要優(you)點(dian)是操(cao)縱(zong)物理(li)化(hua)學（即(ji)，溫(wen)度(du)，pH，滲(shen)透(tou)壓(ya)，O2和CO2張(zhang)力）和生理環(huan)境（即(ji)，激(ji)素和營(ying)養(yang)物濃度(du)），其(qi)中所(suo)述(shu)細(xi)胞繁(fan)殖的能力。除(chu)溫(wen)度(du)，將培養(yang)環(huan)境是(shi)由(you)生長培(pei)養(yang)基進(jin)行(xing)控(kong)制(zhi)。
對於(yu)培養(yang)，只要我(wo)們細(xi)心操(cao)作(zuo)，註意細(xi)節，並不(bu)是(shi)大家說(shuo)的那(na)樣困難(nan)。對於(yu)有經驗(yan)和有(you)條件的客戶(hu)，建(jian)議(yi)由(you)公(gong)司(si)代為(wei)培養(yang)細(xi)胞及進(jin)行(xing)後續研(yan)究(jiu)。

細(xi)胞復(fu)蘇(su)技(ji)術：

1. 取(qu)出(chu)細(xi)胞，迅速放(fang)入(ru)37℃溫(wen)水(shui)中(zhong)快速解(jie)凍(dong)

2. 吸(xi)出(chu)細(xi)胞懸(xuan)液(ye),並加(jia)10倍以上培養(yang)液(ye)

3. 1000r/分(fen)鐘離(li)心(xin)5分(fen)鐘，去除(chu)上清

4. 用(yong)培養(yang)液(ye)適當稀釋(shi)後(hou)接種(zhong)培(pei)養(yang)瓶(ping),放(fang)入37℃ CO2培養(yang)箱靜置培養(yang)

5. 鏡(jing)檢細(xi)胞貼(tie)壁能力，次日更(geng)換(huan)壹(yi)次(ci)培養(yang)液(ye),繼(ji)續培(pei)養(yang)

培(pei)養(yang)方(fang)法(fa)：

收(shou)到細(xi)胞後，在(zai)倒置(zhi)顯微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察整個(ge)細(xi)胞生長情況(kuang)：

如(ru)果細(xi)胞未長滿(man)，用(yong)75%酒(jiu)精噴(pen)灑(sa)整(zheng)個(ge)瓶(ping)消(xiao)毒後放到超(chao)菌臺(tai)內，嚴格(ge)無(wu)菌操(cao)作(zuo)，打開(kai)細(xi)胞培養(yang)瓶(ping)，留(liu)10ml培養(yang)液(ye)繼(ji)續培(pei)養(yang)。

如(ru)果細(xi)胞已(yi)長滿(man)（達80-90%）。即(ji)可(ke)進(jin)行(xing)傳代，具體(ti)步驟如(ru)下(xia)：

a，棄(qi)去培(pei)養(yang)液(ye)，用(yong)PBS洗(xi)1-2次。

b，向瓶(ping)內(nei)加入1.0-2.0ml酶液(ye)，在(zai)倒置(zhi)顯微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察細(xi)胞消化(hua)情況(kuang)，若(ruo)細(xi)胞大部(bu)分(fen)變圓，迅速拿(na)回操(cao)作(zuo)臺(tai)，吸取酶(mei)，加(jia)含有6ml 含10%血清的培養(yang)液(ye)，輕輕吹打細(xi)胞。

c，加(jia)入(ru)等量的的培養(yang)液(ye)，輕輕吹打混勻後吸出(chu)壹(yi)半(ban)，分(fen)到新的培養(yang)

d，傳代比例(li)：1:2-1:3

保存和應(ying)用(yong)：

客戶(hu)可(ke)以(yi)根(gen)據自(zi)己(ji)的需求(qiu)選(xuan)擇(ze)新鮮或者(zhe)凍(dong)存的原代細(xi)胞，如(ru)是(shi)新鮮原代細(xi)胞，客戶(hu)收(shou)到細(xi)胞後應(ying)立(li)即將其放(fang)入CO2細(xi)胞培養(yang)箱內(nei)靜置後2-3h，再進(jin)行(xing)後續的實驗(yan)操(cao)作(zuo)。如(ru)是(shi)凍(dong)存細(xi)胞，客戶(hu)收(shou)到細(xi)胞後應(ying)立(li)即將其放(fang)入液(ye)氮(dan)、-80℃冰箱或(huo)立(li)即(ji)進(jin)行(xing)復(fu)蘇(su)。

細(xi)胞復(fu)蘇(su)的原則：

在(zai)實際(ji)操(cao)作(zuo)中(zhong)，凍(dong)存細(xi)胞要進(jin)行(xing)復(fu)蘇(su)，再培養(yang)傳代。復(fu)蘇(su)細(xi)胞壹(yi)般(ban)采用(yong)快速融(rong)化(hua)法。以(yi)保證細(xi)胞外(wai)結晶(jing)快速融(rong)化(hua)，以避(bi)免(mian)慢速融(rong)化(hua)水分(fen)滲入(ru)細(xi)胞內，再次形(xing)成(cheng)胞內結晶(jing)損傷(shang)細(xi)胞。

1）該(gai)細(xi)胞只能用(yong)於(yu)科研(yan)，不(bu)得用(yong)於(yu)臨床(chuang)。

2）收(shou)到細(xi)胞後首(shou)先觀(guan)察細(xi)胞瓶(ping)是(shi)否完(wan)好(hao)，培養(yang)液(ye)是(shi)否有(you)漏(lou)液、渾濁等現(xian)象(xiang)，若(ruo)有上述現(xian)象(xiang)發(fa)生請及時(shi)和我(wo)們聯(lian)系(xi)。

3）仔細(xi)閱(yue)讀(du)細(xi)胞說明(ming)書，了(le)解(jie)細(xi)胞相關(guan)信息，如(ru)細(xi)胞形態、所(suo)用(yong)培養(yang)基、血清比例(li)、所(suo)需(xu)細(xi)胞因子等。

4）用(yong)75%酒(jiu)精擦拭細(xi)胞瓶(ping)表(biao)面，顯(xian)微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察細(xi)胞狀(zhuang)態。因(yin)運(yun)輸(shu)問(wen)題貼(tie)壁細(xi)胞會(hui)有(you)少(shao)量從(cong)瓶(ping)壁(bi)脫落，將細(xi)胞置於(yu)培養(yang)箱內(nei)靜置培養(yang)過(guo)夜(ye)，隔(ge)天(tian)再取出(chu)觀察(cha)。此時(shi)多(duo)數(shu)細(xi)胞均會(hui)貼(tie)壁，若(ruo)細(xi)胞仍不(bu)能(neng)貼(tie)壁請用(yong)臺盼(pan)藍染(ran)色(se)測(ce)定(ding)細(xi)胞活(huo)力，如(ru)果證實細(xi)胞活(huo)力正常(chang)，請將細(xi)胞離(li)心(xin)後(hou)用(yong)新鮮培養(yang)基再次貼(tie)壁培養(yang)；如(ru)果染(ran)色(se)結果顯(xian)示細(xi)胞無活(huo)力，請拍下照(zhao)片及時(shi)和我(wo)們聯(lian)系(xi)，信息確(que)認後(hou)我(wo)們為(wei)您再免費(fei)寄送(song)壹(yi)次(ci)。

5）請客戶(hu)用(yong)相同(tong)條(tiao)件的培養(yang)基用(yong)於(yu)細(xi)胞培養(yang)。培(pei)養(yang)瓶(ping)內(nei)多余(yu)的培養(yang)基可(ke)收(shou)集(ji)備(bei)用(yong)，細(xi)胞傳代時可(ke)以(yi)壹(yi)定(ding)比例(li)和客戶(hu)自(zi)備的培養(yang)基混合，使細(xi)胞逐漸適應培(pei)養(yang)條(tiao)件;建(jian)議(yi)直接購(gou)買(mai)我(wo)司(si)提供的培養(yang)基。

6）建(jian)議(yi)客戶(hu)收(shou)到細(xi)胞後qian3天(tian)各(ge)拍(pai)幾張(zhang)細(xi)胞照(zhao)片，記錄細(xi)胞狀(zhuang)態，便於(yu)和我(wo)司(si)技(ji)術部(bu)溝通(tong)交流(liu)。

細(xi)胞培養(yang)操(cao)作(zuo)

1）復(fu)蘇(su)細(xi)胞：將含有1 mL細(xi)胞懸(xuan)液(ye)的凍(dong)存管在(zai) 37℃水浴(yu)中(zhong)迅速搖(yao)晃解凍(dong)，加4 mL培(pei)養(yang)基混合均勻(yun)。在(zai)1000 rpm條件下離(li)心(xin)3 min，棄(qi)去上清液，加(jia)1-2 mL培(pei)養(yang)基後吹(chui)勻。然後(hou)將所(suo)有(you)細(xi)胞懸(xuan)液(ye)加入(ru)含適量培(pei)養(yang)基的培養(yang)瓶(ping)中(zhong)培養(yang)過(guo)夜(ye)（或將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)加入(ru)10 cm皿(min)中(zhong)，加入(ru)約8 mL培(pei)養(yang)基，培養(yang)過(guo)夜(ye)）。第(di)二天(tian)換(huan)液並檢查(zha)細(xi)胞密度(du)。

2）細(xi)胞傳代：如(ru)果細(xi)胞密度(du)達(da)80%-90%，即可(ke)進(jin)行(xing)傳代培養(yang)。

a、棄(qi)去培(pei)養(yang)上清，用(yong)不含鈣、鎂(mei)離(li)子的PBS潤洗(xi)細(xi)胞1-2次。

b、加(jia)1 mL消(xiao)化(hua)液培(pei)養(yang)瓶(ping)中(zhong)，使消化(hua)液浸(jin)潤所(suo)有(you)細(xi)胞，將培養(yang)瓶(ping)置(zhi)於(yu)37℃培養(yang)箱中(zhong)消(xiao)化(hua)1-2 min（視(shi)細(xi)胞情況(kuang)而(er)定(ding)），然後(hou)在(zai)顯微鏡(jing)下(xia)觀(guan)察細(xi)胞消化(hua)情況(kuang)，若(ruo)細(xi)胞大部(bu)分(fen)變圓並(bing)脫落，迅速拿(na)回操(cao)作(zuo)臺(tai)，輕敲(qiao)幾下(xia)培(pei)養(yang)瓶(ping)後(hou)加2-3ml培養(yang)基終止(zhi)消化(hua)。輕輕打勻後裝(zhuang)入無菌離(li)心(xin)管中，1000 rpm離(li)心(xin)5 min，棄(qi)去上清液，補(bu)加(jia)1-2 mL培養(yang)液(ye)後(hou)吹(chui)勻。

c、將細(xi)胞懸(xuan)液(ye)按1:2比例(li)分(fen)到新的含8 mL培養(yang)基的新皿(min)中(zhong)或者(zhe)瓶(ping)中(zhong)，置於(yu)培養(yang)箱中(zhong)培(pei)養(yang)。

3）細(xi)胞凍(dong)存：待(dai)細(xi)胞生長狀(zhuang)態良好時(shi)，可(ke)進(jin)行(xing)細(xi)胞凍(dong)存。下(xia)面 T25 瓶(ping)為(wei)例(li)；

a、收(shou)集(ji)細(xi)胞，裝入(ru)無(wu)菌離(li)心(xin)管中，1000 rpm條(tiao)件下離(li)心(xin)4 min，棄(qi)去上清液，用(yong)PBS清洗(xi)壹(yi)遍(bian)，棄盡(jin)PBS，進(jin)行(xing)細(xi)胞計數(shu)。

b、根(gen)據細(xi)胞數(shu)量加(jia)入無血清細(xi)胞凍(dong)存液(ye)，使細(xi)胞密度(du)5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支(zhi)凍(dong)存管凍(dong)存1mL細(xi)胞懸(xuan)液(ye)，註意凍(dong)存管做好(hao)標(biao)識(shi)。

c、將凍(dong)存管放入(ru)-80℃冰(bing)箱，24 h後(hou)轉入液氮(dan)灌儲(chu)存。記(ji)錄凍(dong)存管位置(zhi)以(yi)便下次(ci)拿(na)取。

深(shen)圳(zhen)瑞(rui)清生物信息科(ke)技(ji)有限(xian)公(gong)司(si)經過(guo)數(shu)年的努力發(fa)展(zhan)已(yi)迅速成(cheng)為(wei)集(ji)產(chan)品研發(fa)、經營(ying)為(wei)壹(yi)體(ti)的專業(ye)化(hua)生物工(gong)程(cheng)公(gong)司(si)。公(gong)司(si)具有完(wan)善(shan)的實驗(yan)技(ji)術開(kai)發(fa)平(ping)臺，成(cheng)熟的抗原、抗體(ti)研發(fa)系(xi)統(tong)，熟練掌握各(ge)種(zhong)酶(mei)聯(lian)技(ji)術，結合公(gong)司(si)的研發(fa)團(tuan)隊，可(ke)以(yi)有(you)效(xiao)的保證公(gong)司(si)產(chan)品強的穩定(ding)性(xing)和高的準確(que)性(xing)，同(tong)時(shi)又具有競(jing)爭力的價(jia)格。 公(gong)司(si)主(zhu)營(ying)ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)，目(mu)前(qian)可(ke)以(yi)提(ti)供生化(hua)試(shi)劑(ji)、分(fen)子生物學(xue)試(shi)劑(ji)及試(shi)劑(ji)盒(he)，各(ge)種(zhong)抗體(ti)及免(mian)疫(yi)學試(shi)劑(ji)盒(he)、實(shi)驗(yan)耗材等多門(men)類(lei)上萬種產(chan)品，產(chan)品涉及分(fen)子生物學(xue)、細(xi)胞生物學(xue)、免疫(yi)學等生命科(ke)學(xue)的各(ge)個(ge)領(ling)域(yu)。