人(ren)小氣道(dao)平滑(hua)肌(ji)細胞(bao)

人(ren)小(xiao)氣道(dao)平滑(hua)肌(ji)細胞(bao)需(xu)要(yao)準備(bei)好(hao)細胞(bao)所(suo)要用(yong)到的(de)培養基和(he)相(xiang)關(guan)試(shi)劑，雖(sui)然所有的貼壁(bi)，半(ban)貼壁(bi)或(huo)者(zhe)懸浮細胞(bao)處理方式差(cha)不多，但是不同的實驗(yan)室培養(yang)條(tiao)件和(he)處理力(li)度(du)還有試(shi)劑的(de)批間(jian)差(cha)這些(xie)問題(ti)存(cun)在(zai)，也(ye)會(hui)導(dao)致對(dui)細胞(bao)處理不當，  或(huo)者(zhe)環境的(de)不適應(ying)而造成(cheng)細胞(bao)的(de)死亡。
人(ren)小(xiao)氣道(dao)平滑(hua)肌(ji)細胞(bao)培(pei)養(yang)物(wu)的(de)生理環境不同時(shi)定(ding)義為(wei)其(qi)物(wu)理化(hua)學環境中(zhong)，更(geng)好(hao)地(di)理解血清的(de)組件(jian)，所必(bi)需的增(zeng)殖(zhi)的(de)生(sheng)長(chang)因(yin)子的鑒(jian)定(ding)，並更(geng)好(hao)地(di)理解細胞(bao)在(zai)培養的(de)微環境（即，細胞(bao) - 細胞(bao)相(xiang)互(hu)作用(yong)，氣(qi)體的(de)擴散，與(yu)基質相(xiang)互(hu)作用(yong)）現(xian)在(zai)允許(xu)在無(wu)血(xue)清培(pei)養基中某些細胞(bao)系的(de)培養(yang)。
培(pei)養(yang)物(wu)的(de)主要(yao)優點是(shi)操(cao)縱物(wu)理化(hua)學（即，溫(wen)度(du)，pH，滲透壓，O2和(he)CO2張力(li)）和(he)生理環境（即，激素和(he)營養(yang)物(wu)濃(nong)度(du)），其(qi)中所(suo)述(shu)細胞(bao)繁殖的能(neng)力(li)。除(chu)溫(wen)度(du)，將(jiang)培養環境是(shi)由生長(chang)培(pei)養(yang)基進(jin)行(xing)控(kong)制(zhi)。
對(dui)於培養(yang)，只要我們(men)細心操作，註(zhu)意(yi)細節，並(bing)不是大家(jia)說的那(na)樣(yang)困難(nan)。對(dui)於有經驗(yan)和(he)有條(tiao)件的(de)客(ke)戶(hu)，建議(yi)由公司(si)代(dai)為培(pei)養(yang)細胞(bao)及(ji)進(jin)行(xing)後(hou)續(xu)研(yan)究。

細胞(bao)復(fu)蘇(su)技術：

1. 取出細胞(bao)，迅(xun)速放(fang)入(ru)37℃溫(wen)水(shui)中快速(su)解凍(dong)

2. 吸出細胞(bao)懸(xuan)液,並加(jia)10倍(bei)以上培養(yang)液(ye)

3. 1000r/分鐘離心5分鐘，去(qu)除上清

4. 用(yong)培(pei)養液適(shi)當(dang)稀(xi)釋(shi)後(hou)接(jie)種培(pei)養瓶,放入37℃ CO2培養(yang)箱(xiang)靜(jing)置培養

5. 鏡檢細胞(bao)貼壁(bi)能(neng)力(li)，次(ci)日(ri)更換壹次(ci)培(pei)養液,繼續(xu)培(pei)養(yang)

培養(yang)方法(fa)：

收到細胞(bao)後(hou)，在倒(dao)置顯微鏡下觀(guan)察整(zheng)個細胞(bao)生(sheng)長(chang)情(qing)況(kuang)：

如果(guo)細胞(bao)未長(chang)滿(man)，用(yong)75%酒精(jing)噴灑(sa)整(zheng)個瓶(ping)消(xiao)毒後放(fang)到超(chao)菌臺(tai)內，嚴(yan)格無(wu)菌操(cao)作，打(da)開細胞(bao)培(pei)養瓶，留(liu)10ml培養(yang)液繼(ji)續培養。

如果(guo)細胞(bao)已長(chang)滿(man)（達80-90%）。即可進(jin)行(xing)傳代，具(ju)體步(bu)驟(zhou)如下：

a，棄去(qu)培養(yang)液(ye)，用(yong)PBS洗(xi)1-2次(ci)。

b，向(xiang)瓶(ping)內加入1.0-2.0ml酶液，在(zai)倒(dao)置顯微鏡下觀(guan)察細胞(bao)消(xiao)化情(qing)況(kuang)，若細胞(bao)大(da)部分變圓(yuan)，迅(xun)速拿(na)回(hui)操(cao)作臺(tai)，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的(de)培養(yang)液，輕(qing)輕吹(chui)打(da)細胞(bao)。

c，加入(ru)等量的(de)的培養液(ye)，輕輕吹(chui)打(da)混勻(yun)後吸(xi)出壹半(ban)，分到新的培(pei)養

d，傳代比(bi)例：1:2-1:3

保(bao)存(cun)和(he)應(ying)用(yong)：

客戶(hu)可(ke)以根據自(zi)己(ji)的(de)需(xu)求(qiu)選(xuan)擇新鮮或(huo)者(zhe)凍(dong)存(cun)的(de)原代細胞(bao)，如(ru)是新鮮原代細胞(bao)，客(ke)戶收到細胞(bao)後(hou)應(ying)立即將(jiang)其(qi)放入(ru)CO2細胞(bao)培(pei)養箱內(nei)靜(jing)置後2-3h，再(zai)進(jin)行(xing)後(hou)續(xu)的(de)實驗(yan)操(cao)作。如是(shi)凍(dong)存(cun)細胞(bao)，客(ke)戶收到細胞(bao)後(hou)應(ying)立即將(jiang)其(qi)放入(ru)液(ye)氮(dan)、-80℃冰箱(xiang)或(huo)立(li)即進(jin)行(xing)復(fu)蘇(su)。

細胞(bao)復(fu)蘇(su)的原則：

在實(shi)際(ji)操作中，凍(dong)存(cun)細胞(bao)要(yao)進(jin)行(xing)復(fu)蘇(su)，再(zai)培養(yang)傳代。復(fu)蘇(su)細胞(bao)壹般采(cai)用(yong)快速(su)融化(hua)法(fa)。以保(bao)證細胞(bao)外(wai)結晶快速(su)融化(hua)，以避免慢(man)速融(rong)化水(shui)分滲入細胞(bao)內(nei)，再(zai)次(ci)形(xing)成胞內結晶損傷(shang)細胞(bao)。

1）該細胞(bao)只能(neng)用(yong)於科研(yan)，不得用(yong)於臨床(chuang)。

2）收到細胞(bao)後(hou)首先(xian)觀(guan)察細胞(bao)瓶(ping)是否完好(hao)，培養(yang)液是否有漏液(ye)、渾濁(zhuo)等現(xian)象(xiang)，若有上述現(xian)象(xiang)發(fa)生請(qing)及(ji)時(shi)和(he)我們(men)聯(lian)系。

3）仔細閱(yue)讀(du)細胞(bao)說明書(shu)，了解細胞(bao)相(xiang)關(guan)信息，如(ru)細胞(bao)形(xing)態、所用(yong)培(pei)養基、血清比(bi)例、所需(xu)細胞(bao)因(yin)子等。

4）用(yong)75%酒精(jing)擦拭細胞(bao)瓶(ping)表面(mian)，顯(xian)微鏡下觀(guan)察細胞(bao)狀(zhuang)態。因運(yun)輸問(wen)題(ti)貼壁(bi)細胞(bao)會(hui)有(you)少量從(cong)瓶壁(bi)脫(tuo)落(luo)，將(jiang)細胞(bao)置於培養(yang)箱內(nei)靜(jing)置培養過夜，隔(ge)天(tian)再(zai)取出觀(guan)察。此(ci)時(shi)多(duo)數(shu)細胞(bao)均(jun)會(hui)貼壁(bi)，若細胞(bao)仍(reng)不能(neng)貼壁(bi)請(qing)用(yong)臺(tai)盼藍染色(se)測(ce)定(ding)細胞(bao)活力(li)，如(ru)果證(zheng)實(shi)細胞(bao)活力(li)正常(chang)，請(qing)將(jiang)細胞(bao)離心後用(yong)新鮮培(pei)養基再(zai)次(ci)貼壁(bi)培(pei)養；如(ru)果染色(se)結果顯(xian)示(shi)細胞(bao)無(wu)活力(li)，請(qing)拍下照片及(ji)時(shi)和(he)我們(men)聯(lian)系，信息確(que)認後我們(men)為(wei)您(nin)再(zai)免費(fei)寄(ji)送壹次(ci)。

5）請客(ke)戶(hu)用(yong)相(xiang)同(tong)條(tiao)件的(de)培(pei)養(yang)基用(yong)於細胞(bao)培(pei)養。培養(yang)瓶(ping)內多余(yu)的(de)培養基可收集備用(yong)，細胞(bao)傳代時(shi)可(ke)以壹定(ding)比(bi)例和(he)客戶(hu)自備(bei)的培養基混合(he)，使(shi)細胞(bao)逐漸(jian)適應(ying)培養條(tiao)件;建(jian)議(yi)直接(jie)購(gou)買我司(si)提(ti)供(gong)的(de)培養基。

6）建議(yi)客戶收到細胞(bao)後(hou)qian3天(tian)各拍幾(ji)張細胞(bao)照片，記錄細胞(bao)狀(zhuang)態，便於和(he)我司(si)技(ji)術部(bu)溝(gou)通交(jiao)流(liu)。

細胞(bao)培(pei)養操作

1）復(fu)蘇(su)細胞(bao)：將(jiang)含有1 mL細胞(bao)懸(xuan)液的凍(dong)存(cun)管在 37℃水(shui)浴中(zhong)迅(xun)速搖晃(huang)解凍(dong)，加(jia)4 mL培(pei)養(yang)基混合(he)均(jun)勻(yun)。在1000 rpm條(tiao)件下離心3 min，棄去(qu)上清液(ye)，加1-2 mL培(pei)養基後吹(chui)勻(yun)。然後將(jiang)所有細胞(bao)懸(xuan)液加入(ru)含適量培(pei)養基的培養瓶(ping)中(zhong)培(pei)養過(guo)夜（或(huo)將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液加入(ru)10 cm皿(min)中，加入約(yue)8 mL培(pei)養基，培養過夜）。第二天(tian)換液(ye)並(bing)檢查(zha)細胞(bao)密(mi)度(du)。

2）細胞(bao)傳代：如果細胞(bao)密(mi)度(du)達80%-90%，即可進(jin)行(xing)傳代培養。

a、棄去(qu)培養(yang)上清，用(yong)不含鈣、鎂(mei)離子的PBS潤洗(xi)細胞(bao)1-2次(ci)。

b、加1 mL消(xiao)化液(ye)培養(yang)瓶(ping)中(zhong)，使消(xiao)化液(ye)浸(jin)潤所有(you)細胞(bao)，將(jiang)培養瓶置於37℃培養(yang)箱中(zhong)消(xiao)化1-2 min（視(shi)細胞(bao)情(qing)況(kuang)而定(ding)），然後在顯微鏡下觀(guan)察細胞(bao)消(xiao)化情(qing)況(kuang)，若細胞(bao)大(da)部分變圓(yuan)並脫(tuo)落(luo)，迅(xun)速拿(na)回(hui)操(cao)作臺(tai)，輕敲幾(ji)下培(pei)養瓶(ping)後加2-3ml培(pei)養基終止消(xiao)化。輕(qing)輕打(da)勻(yun)後裝入(ru)無(wu)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去(qu)上清液(ye)，補加(jia)1-2 mL培養(yang)液後吹(chui)勻(yun)。

c、將(jiang)細胞(bao)懸(xuan)液按(an)1:2比(bi)例分到新的含8 mL培養基的新皿中(zhong)或(huo)者(zhe)瓶中，置於培養(yang)箱中(zhong)培養。

3）細胞(bao)凍(dong)存(cun)：待細胞(bao)生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態(tai)良(liang)好(hao)時(shi)，可(ke)進(jin)行(xing)細胞(bao)凍(dong)存(cun)。下面(mian) T25 瓶(ping)為例；

a、收集細胞(bao)，裝入(ru)無(wu)菌離心管中，1000 rpm條(tiao)件下離心4 min，棄去(qu)上清液(ye)，用(yong)PBS清洗(xi)壹遍，棄(qi)盡(jin)PBS，進(jin)行(xing)細胞(bao)計(ji)數。

b、根據細胞(bao)數(shu)量加(jia)入無血清細胞(bao)凍(dong)存(cun)液(ye)，使(shi)細胞(bao)密(mi)度(du)5×106~1×107/mL，輕輕混(hun)勻(yun)，每支(zhi)凍(dong)存(cun)管凍(dong)存(cun)1mL細胞(bao)懸(xuan)液，註(zhu)意(yi)凍(dong)存(cun)管做好(hao)標(biao)識(shi)。

c、將(jiang)凍(dong)存(cun)管放入(ru)-80℃冰箱(xiang)，24 h後(hou)轉入液氮(dan)灌(guan)儲(chu)存(cun)。記錄凍(dong)存(cun)管位置以便下次(ci)拿(na)取。

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