大(da)鼠(shu)四(si)氫孕(yun)酮(tong)（Allopregnanolone）ELISA檢(jian)測試(shi)劑(ji)盒(he)說(shuo)明

檢(jian)測原(yuan)理

試(shi)劑(ji)盒(he)采用雙抗(kang)體壹(yi)步夾(jia)心法(fa)酶(mei)聯免(mian)疫吸(xi)附試(shi)驗（ELISA）。往預先(xian)包(bao)被四(si)氫孕(yun)酮(tong)（Allopregnanolone）抗(kang)體的包(bao)被微孔中(zhong)，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)標(biao)本、標(biao)準品(pin)、HRP標(biao)記(ji)的檢(jian)測抗(kang)體，經(jing)過溫育(yu)並徹di洗滌(di)。用底(di)物TMB顯(xian)色，TMB在(zai)過(guo)氧(yang)化物酶的催化下(xia)轉化成(cheng)藍(lan)色(se)，並(bing)在(zai)酸(suan)的作用(yong)下轉化成(cheng)最終的黃(huang)色。顏(yan)色(se)的深淺(qian)和(he)樣品(pin)中的四(si)氫孕(yun)酮(tong)（Allopregnanolone）呈正(zheng)相關(guan)。用(yong)酶(mei)標(biao)儀在450nm 波長下測定吸光(guang)度（OD 值(zhi)），計(ji)算樣品濃度。

樣品(pin)收(shou)集、處理及(ji)保(bao)存(cun)方(fang)法(fa)

1.  血(xue)清：使用不(bu)含(han)熱(re)原(yuan)和(he)內(nei)毒素(su)的試管，操作(zuo)過(guo)程中避免(mian)任何細胞刺(ci)激(ji)，收集血(xue)液後(hou)，3000轉離心(xin)10分(fen)鐘將(jiang)血(xue)清(qing)和(he)紅細(xi)胞迅速小心(xin)地分(fen)離。

2.  血(xue)漿：EDTA、檸檬酸(suan)鹽或(huo)肝(gan)素(su)抗(kang)凝(ning)。3000轉離心(xin)30分(fen)鐘取(qu)上清(qing)。

3.  細(xi)胞上清(qing)液：3000轉離心(xin)10分(fen)鐘去(qu)除顆(ke)粒和(he)聚合(he)物。

4.  組織(zhi)勻漿：將組織(zhi)加(jia)入(ru)適(shi)量生(sheng)理鹽水(shui)搗(dao)碎(sui)。3000轉離心(xin)10分(fen)鐘取(qu)上清(qing)。

5.  保(bao)存(cun)：如(ru)果(guo)樣(yang)本收集後(hou)不(bu)及(ji)時(shi)檢(jian)測，請按壹(yi)次(ci)用(yong)量(liang)分(fen)裝，凍存(cun)於(yu)-20℃，避免(mian)反(fan)復凍融(rong)，在室(shi)溫下(xia)解(jie)凍並(bing)確(que)保(bao)樣(yang)品(pin)均勻地充(chong)分(fen)解(jie)凍。

自備(bei)物品

1. 酶(mei)標(biao)儀（450nm）

2. 高(gao)精度加(jia)樣(yang)器及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱(xiang)

操作(zuo)註(zhu)意事(shi)項(xiang)

1. 試劑(ji)盒(he)保(bao)存(cun)在(zai)2-8℃，使(shi)用(yong)前室(shi)溫平(ping)衡20分(fen)鐘。從冰箱取出的濃縮(suo)洗滌(di)液會(hui)有結晶(jing)，這屬(shu)於正(zheng)常現(xian)象，水(shui)浴(yu)加(jia)熱(re)使(shi)結晶(jing)wan全(quan)溶解(jie)後(hou)再(zai)使用。

2. 實驗中不(bu)用(yong)的板(ban)條(tiao)應立(li)即放回自封(feng)袋(dai)中，密封(feng)（低溫幹(gan)燥(zao)）保(bao)存(cun)。

3. 濃度為0的S0號標(biao)準品(pin)即可視(shi)為陰性(xing)對照或(huo)者空(kong)白(bai)；按照說(shuo)明書(shu)操作(zuo)時(shi)樣(yang)本已經(jing)稀釋(shi)5倍，最終結果(guo)乘(cheng)以5才是樣本(ben)實際(ji)濃度。

4.  嚴格(ge)按(an)照說(shuo)明書(shu)中(zhong)標(biao)明的時(shi)間(jian)、加液量及(ji)順序(xu)進行(xing)溫育(yu)操作(zuo)。

5. 所(suo)有(you)液體組分使用(yong)前(qian)充(chong)分(fen)搖(yao)勻。

試(shi)劑(ji)盒(he)組(zu)成(cheng)

註：標(biao)準品(pin)（S0-S5）濃度依次(ci)為：0、2、4、8、16、32 nmol/L

試劑(ji)的準備(bei)

20×洗滌(di)緩沖(chong)液的稀釋(shi)：蒸餾(liu)水(shui)按(an)1：20稀釋(shi)，即1份(fen)的20×洗滌(di)緩沖(chong)液加19份(fen)的蒸餾(liu)水(shui)。

洗板(ban)方(fang)法(fa)

1. 手(shou)工洗板(ban)：甩盡孔內(nei)液體，每孔加(jia)滿(man)洗滌(di)液，靜(jing)置(zhi)1min後(hou)甩盡孔內(nei)液體，在吸水(shui)紙(zhi)上拍幹(gan)，如(ru)此洗板(ban)5次(ci)。

2. 自動(dong)洗板(ban)機：每(mei)孔註(zhu)入(ru)洗液350μL，浸泡1min，洗板(ban)5次(ci)。

操作(zuo)步驟(zhou)

1. 從室(shi)溫平(ping)衡20min後(hou)的鋁箔(bo)袋(dai)中取出(chu)所(suo)需(xu)板(ban)條(tiao)，剩余板(ban)條(tiao)用自封(feng)袋(dai)密封(feng)放回4℃。

2.  設置標(biao)準品(pin)孔和(he)樣本(ben)孔，標(biao)準品(pin)孔各(ge)加(jia)不(bu)同(tong)濃度的標(biao)準品(pin)50μL；

3. 樣(yang)本(ben)孔先(xian)加(jia)待測樣(yang)本(ben)10μL，再(zai)加樣本稀釋(shi)液40μL；空白孔不(bu)加(jia)。

4.  除空(kong)白孔外，標(biao)準品(pin)孔和(he)樣本(ben)孔中(zhong)每(mei)孔加(jia)入(ru)辣根(gen)過氧(yang)化物酶（HRP）標(biao)記(ji)的檢(jian)測抗(kang)體100μL，用(yong)封(feng)板(ban)膜(mo)封(feng)住反(fan)應孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋(guo)或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)溫育(yu)60min。

5. 棄去液體，吸水(shui)紙(zhi)上拍幹(gan)，每(mei)孔加(jia)滿(man)洗滌(di)液，靜(jing)置(zhi)1min，甩去洗滌(di)液，吸水(shui)紙(zhi)上拍幹(gan)，如(ru)此重復(fu)洗板(ban)5次(ci)（也可用(yong)洗板(ban)機洗板(ban)）。

6. 每孔加(jia)入(ru)底物A、B各(ge)50μL，37℃避光(guang)孵(fu)育(yu)15min。

7. 每孔加(jia)入(ru)終止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處測定各(ge)孔的OD值(zhi)。

結果(guo)判斷

繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線：在Excel工作(zuo)表(biao)中，以標(biao)準品(pin)濃度作橫坐標(biao)，對應OD值(zhi)作(zuo)縱坐標(biao)，繪(hui)制(zhi)出(chu)標(biao)準品(pin)線(xian)性(xing)回歸(gui)曲線，按曲線方(fang)程(cheng)計(ji)算(suan)各(ge)樣(yang)本(ben)濃度值(zhi)。

試(shi)劑(ji)盒(he)性(xing)能(neng)

1. 準確(que)性(xing)：標(biao)準品(pin)線(xian)性(xing)回歸(gui)與(yu)預(yu)期(qi)濃度相關(guan)系(xi)數(shu)R值(zhi)，大(da)於等於0.9900。

2. 靈(ling)敏(min)度：最di檢(jian)測濃度小於(yu)0.1 nmol/L。

3. 特異(yi)性(xing)：不(bu)與(yu)其(qi)它(ta)可溶性(xing)結構(gou)類(lei)似(si)物交叉(cha)反(fan)應。

4. 重(zhong)復(fu)性(xing)：板(ban)內(nei)、板(ban)間變(bian)異系(xi)數(shu)均小於(yu)15%。

5. 貯(zhu)藏(zang)：2-8℃，避光(guang)防潮保(bao)存(cun)。

6. 有(you)效(xiao)期(qi)：6個(ge)月(yue)

免(mian)責聲明

1. 試(shi)劑(ji)盒(he)僅(jin)供研(yan)究(jiu)使用，不(bu)得用於臨床(chuang)實驗(yan)或人體實(shi)驗，否則所(suo)產(chan)生的壹切(qie)後(hou)果，由實(shi)驗(yan)者承(cheng)擔(dan)，本公司概不(bu)負(fu)責。

2. 嚴格按照說(shuo)明書(shu)操作(zuo)，實(shi)驗者違(wei)反(fan)說明書(shu)操作(zuo)，後(hou)果由實(shi)驗(yan)者承(cheng)擔(dan)。