影(ying)響(xiang)ELISA實驗檢測結(jie)果的(de)因素

      ELISA 測定(ding)的(de)陽(yang)性(xing)判斷(duan)值, 通(tong)常是將大量(liang)陰性和(he)陽(yang)性(xing)人群的測定(ding)數據進行(xing)統(tong)計(ji)分析(xi)後(hou)確(que)定(ding)的(de), 其(qi)確定(ding)依據(ju)為判(pan)斷(duan)結(jie)果的(de)假(jia)陽(yang)性(xing)和(he)假(jia)陰性率低(di)。在陽(yang)性(xing)判斷(duan)值周圍(wei)壹(yi)定(ding)範(fan)圍(wei)內之外的測定(ding)結(jie)果可(ke)歸(gui)為可(ke)疑, 亦(yi)即ELISA 測定(ding)的(de)“灰區(qu)"。“灰(hui)區(qu)"的(de)大(da)小(xiao)可(ke)用統計(ji)學(xue)方法(fa)確定(ding)。測定(ding)結(jie)果處(chu)於(yu)“灰(hui)區(qu)"的(de)樣(yang)本, 可(ke)通(tong)過確認(ren)試驗(yan)或(huo)追(zhui)蹤(zong)檢測來(lai)確(que)定(ding)到(dao)底是陽(yang)性(xing)還是陰性ELISA“灰區(qu)"是(shi)把(ba)定(ding)量(liang)分析(xi)的(de)正(zheng)常(chang)值範(fan)圍(wei)引入(ru)定(ding)性(xing)分析(xi)而(er)建(jian)立的概念(nian)。

灰(hui)區(qu)的(de)設置有二種(zhong): (1)CO × (1±C) , C 為該(gai)試劑(ji)的(de)批(pi)內C (壹(yi)般在15%～ 20% 間) ; (2)CO ±2S, S 為做(zuo)室內ROC 的S。
另(ling)外, 個(ge)人認為: ELISA“灰(hui)區"對於(yu)不(bu)同項目(mu)和(he)應(ying)用的(de)領(ling)域(yu)不(bu)同, 其(qi)設置不能壹(yi)概而(er)論。根(gen)據美(mei)國疾(ji)病控制(zhi)中心 (CDC) 對美國Ortho 的抗(kang)HC 檢測的ELISA 試劑(ji)盒(he)進行(xing)研(yan)究, 發(fa)現(xian)只有(you)檢驗結(jie)果S/CO ≥318 時(shi), 高度預(yu)示(shi)HC 抗(kang)體真陽(yang)性(xing)狀態(tai); 若檢驗結(jie)果S/CO < 318, 存(cun)在較高的假(jia)陽(yang)性(xing)。在血站(zhan)系(xi)統的(de)獻血員(yuan)抗(kang)HC 篩(shai)查(zha)用(yong)上(shang)述兩種灰區(qu)的(de)設置方法(fa)沒(mei)有什麽不(bu)可(ke); 如(ru)果(guo)臨(lin)床實驗室抗(kang)HC 的灰區也(ye)按(an)前(qian)者設置,勢必存(cun)在較多(duo)的(de)假(jia)陽(yang)性(xing)。
ELISA 質量保證(zheng)是(shi)壹(yi)個復雜的(de)過程, 許(xu)多重要(yao)的(de)環節(jie)都(dou)影響到(dao)檢測的質(zhi)量(liang)，現(xian)分析(xi)如(ru)下(xia)。

1、方法(fa)學(xue)的(de)影(ying)響
ELISA 測定(ding)模(mo)式包括(kuo)以下(xia)幾(ji)種(zhong): 雙(shuang)抗(kang)體夾心法(fa)、間接(jie)法(fa)、雙(shuang)抗(kang)原夾心法(fa)、IgM 抗(kang)體捕捉法(fa)、競爭(zheng)抑(yi)制法(fa), 其(qi)中競爭(zheng)抑(yi)制法(fa)因受操(cao)作(zuo)時(shi)差(cha)所引(yin)起(qi)的bi公(gong)平(ping)競(jing)爭(zheng)等因素的(de)影(ying)響(xiang), 結(jie)果重復性較差, 質(zhi)量(liang)較(jiao)難(nan)控制(zhi)。

2、樣(yang)本因素
標本幹(gan)擾(rao)因素包(bao)括(kuo)內源性(xing)幹(gan)擾(rao)因素和(he)外(wai)源性(xing)幹(gan)擾(rao)因素,前(qian)者包(bao)括類風濕(shi)因子(zi)、補體(ti)、異嗜性(xing)抗(kang)體、自身(shen)抗(kang)體、溶(rong)菌酶等, 後者包(bao)括標本溶(rong)血、標本被(bei)汙(wu)染(ran)、標本貯存(cun)時(shi)間(jian)過長(chang)、標本凝(ning)固不(bu)全(quan)、冷(leng)凍(dong)標本的(de)反復凍(dong)融等(deng)。其(qi)中外源性(xing)幹(gan)擾(rao)因素是(shi)我(wo)們(men)在檢測過程中可(ke)以避免也(ye)是(shi)必(bi)須(xu)避(bi)免(mian)的(de)因素, 而(er)避(bi)免(mian)內源性(xing)因素的(de)幹(gan)擾(rao)則(ze)主要(yao)通(tong)過選擇(ze)合(he)適(shi)的試劑(ji)盒(he)。在臨(lin)床中遇(yu)到(dao)少(shao)見的(de)疑難(nan)病例(li)時(shi)應(ying)當(dang)考慮(lv)到(dao)內源性(xing)幹(gan)擾(rao)因素的(de)存(cun)在。以下(xia)對外源性(xing)幹(gan)擾(rao)因素進行(xing)簡(jian)要(yao)說明(ming):
標本溶(rong)血　要(yao)註(zhu)意避(bi)免(mian)出現(xian)嚴(yan)重溶(rong)血。血紅(hong)蛋白中含(han)有血紅(hong)素基(ji)團, 其(qi)具有類過氧化(hua)物(wu)的活(huo)性, 因此(ci), 在以辣(la)根(gen)過氧化(hua)物(wu)酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標記酶的ELISA 測定(ding)中, 如(ru)果(guo)血清(qing)標本中血紅(hong)蛋白濃(nong)度(du)較高, 則(ze)其(qi)就很(hen)容易(yi)在溫(wen)育過程中吸(xi)附於(yu)固(gu)相, 從(cong)而(er)與後(hou)面(mian)加(jia)入(ru)的底物反(fan)應(ying)顯色。

3、試劑(ji)因素
試劑(ji)的(de)選(xuan)擇(ze)　檢測的原(yuan)理均基(ji)於(yu)抗(kang)原抗(kang)體反應(ying)。由於(yu)該(gai)反(fan)應(ying)過程受多種(zhong)因素的(de)影(ying)響(xiang), 如(ru)普(pu)遍存(cun)在基(ji)質效(xiao)應(ying)、交叉反(fan)應(ying)等, 因而(er)檢測結(jie)果難(nan)以溯源, 不(bu)同方法(fa)、不同試劑(ji)之間甚(shen)至(zhi)同壹(yi)試劑(ji)不(bu)同批(pi)號(hao)間結(jie)果均缺乏(fa)可(ke)比性。試劑(ji)質(zhi)量(liang)在很大(da)程(cheng)度上(shang)決定(ding)了檢測的水(shui)平(ping), 因此(ci)在引入(ru)新(xin)項(xiang)目(mu)之前(qian)必須(xu)對試劑(ji)進行(xing)嚴(yan)格(ge)的(de)評(ping)估。試劑(ji)的(de)評(ping)估有(you)以下(xia)幾(ji)個(ge)步(bu)驟(zhou):

1）、 確(que)定(ding)開(kai)展該(gai)項(xiang)目(mu)的必(bi)要(yao)性(xing);

2）、了解(jie)該(gai)項(xiang)目(mu)現(xian)有的(de)檢測方法(fa)和(he)原(yuan)理;

3）、在了解(jie)試劑(ji)的(de)組成基(ji)礎上(shang)選擇(ze)多(duo)家(jia)試劑(ji)盒(he)進行(xing)比較,判(pan)斷(duan)標準(zhun)先(xian)選(xuan)參(can)考方法(fa)或參(can)考物質, 其(qi)次(ci)為臨(lin)床的滿意度(du)及(ji)權wei 機(ji)構(gou)的(de)報(bao)告如(ru)各級室間質(zhi)量(liang)評價(jia)、CDC 報(bao)告等(deng);

4）、 定(ding)期(qi)對檢測結(jie)果進行(xing)追(zhui)蹤(zong)反(fan)饋直至最(zui)終(zhong)認(ren)可(ke)該(gai)試劑(ji)。

4、操(cao)作(zuo)因素對ELISA 結(jie)果的(de)影響
ELISA 測定(ding)壹(yi)般遵循以(yi)下(xia)步(bu)驟(zhou): 固(gu)相包(bao)被(bei)→加(jia)樣(yang)品(pin)→溫(wen)育→洗(xi)滌(di)→加(jia)酶結(jie)合(he)物(wu)→溫(wen)育→洗(xi)滌(di)→加(jia)底物→溫(wen)育→顯(xian)色→終(zhong)止(zhi)顯色→比色。
ELISA 操(cao)作(zuo)步(bu)驟(zhou)復雜, 操(cao)作(zuo)不當(dang)將引起(qi)較(jiao)大的誤(wu)差。以(yi)下(xia)敘述各個(ge)步(bu)驟(zhou)中的影(ying)響因素。加(jia)樣(yang)器(qi)是(shi)壹(yi)種比較精(jing)密的工(gong)具, 其(qi)在長(chang)時(shi)間(jian)使(shi)用(yong)時(shi)會(hui)因機(ji)械磨(mo)損(sun)或(huo)者推(tui)動桿(gan)內附著(zhe)血痂(jia)等(deng)原(yuan)因造(zao)成加(jia)樣(yang)不(bu)準(zhun), 尤(you)其(qi)是對於(yu)樣(yang)本量(liang)較大(da)的(de)臨(lin)床實驗室, 因此(ci)必須(xu)定(ding)期(qi)對加(jia)液(ye)器進行(xing)維護和(he)校準(zhun)。每(mei)次(ci)加(jia)不(bu)同的標本時(shi)均需(xu)更(geng)換(huan)吸(xi)嘴, 以(yi)免(mian)發(fa)生交叉汙(wu)染(ran)。加(jia)樣(yang)時(shi)速(su)度(du)不(bu)可(ke)太快, 避免將標本加(jia)在孔壁上部(bu), 並註(zhu)意不(bu)要(yao)濺出或(huo)產生(sheng)氣(qi)泡(pao)。加(jia)樣(yang)時(shi)還(hai)應(ying)當(dang)註(zhu)意操(cao)作(zuo)時(shi)差(cha)對結(jie)果的(de)影響, 操(cao)作(zuo)時(shi)差(cha)是(shi)指加(jia)入(ru)標本、試劑(ji)及(ji)混(hun)勻(yun)時(shi)間(jian)的(de)差(cha)異。操(cao)作(zuo)時(shi)差(cha)在每(mei)個(ge)實驗中都存(cun)在, 尤(you)其(qi)是手工(gong)操(cao)作(zuo), 日(ri)常(chang)檢測標本多(duo)達幾(ji)百(bai)個(ge),從(cong)加(jia)入(ru)第(di)壹(yi)個標本到(dao)最後(hou)壹(yi)個標本, 需(xu)幾十(shi)分鐘, 加(jia)入(ru)試劑(ji)及(ji)混(hun)勻(yun)等(deng)均存(cun)在著(zhe)前(qian)後時(shi)間(jian)差(cha)異, 使抗(kang)原抗(kang)體反應(ying)和(he)酶促反應(ying)時(shi)間(jian)不(bu)壹(yi)致(zhi), 操(cao)作(zuo)時(shi)差(cha)對競爭(zheng)法(fa)檢測的結(jie)果影(ying)響更(geng)大(da), 在加(jia)酶結(jie)合(he)物(wu)和(he)底物時(shi)可(ke)用定(ding)量(liang)多道(dao)。