植(zhi)物(wu)ELISA試(shi)劑(ji)盒預(yu)實驗操(cao)作(zuo)流程(cheng)

植(zhi)物ELISA試(shi)劑(ji)盒預(yu)實驗的核心目(mu)的(de)是摸索(suo)最(zui)佳(jia)實驗條件，排查(zha)樣本(ben)、試(shi)劑(ji)兼容(rong)性(xing)問題(ti)，避免正式(shi)實驗因條件不當(dang)導致失(shi)敗(bai)。

其關鍵(jian)操(cao)作(zuo)步驟(zhou)和核(he)心目(mu)標(biao)如下(xia)：

1. 樣本(ben)稀(xi)釋度篩(shai)選(xuan)：用1-2個代(dai)表性(xing)樣本(ben)，設(she)置(zhi)3-5個梯(ti)度稀釋度（如1:10、1:50、1:100等(deng)），確定(ding)能使檢(jian)測(ce)值(zhi)落(luo)在(zai)試(shi)劑(ji)盒標(biao)準曲(qu)線(xian)線(xian)性(xing)範(fan)圍內(nei)的(de)最(zui)佳(jia)稀釋比，避(bi)免(mian)信號(hao)過(guo)強(qiang)或(huo)過弱。

2. 試(shi)劑(ji)有(you)效(xiao)性(xing)驗(yan)證(zheng)：快速(su)檢(jian)測(ce)試(shi)劑(ji)盒內(nei)關鍵(jian)試(shi)劑(ji)（如酶(mei)標(biao)抗(kang)體(ti)、底(di)物(wu)）是否在(zai)有(you)效(xiao)期內且(qie)活性(xing)正常(chang)，通(tong)過陽(yang)性(xing)對(dui)照和陰(yin)性(xing)對(dui)照的信(xin)號(hao)差值，判(pan)斷(duan)試(shi)劑(ji)是否可用。

3. 幹(gan)擾因素排查(zha)：檢(jian)測(ce)植(zhi)物(wu)樣本(ben)中(zhong)可(ke)能存在(zai)的色(se)素(su)、多(duo)糖、酚類物質(zhi)是否會(hui)幹(gan)擾檢(jian)測(ce)（如(ru)導致背(bei)景值(zhi)過高），提前(qian)確定(ding)是否需要(yao)增(zeng)加樣本(ben)純(chun)化(hua)步(bu)驟(zhou)。

1. 實驗前(qian)準(zhun)備(bei)（0.5h）

◦ 試(shi)劑(ji)準備(bei)：將試(shi)劑(ji)盒內(nei)所有(you)試(shi)劑(ji)（標(biao)準品(pin)、酶(mei)標(biao)抗(kang)體(ti)、底(di)物(wu)、洗(xi)滌液等(deng)）從冰(bing)箱(xiang)取(qu)出，在(zai)室溫(wen)下(xia)平衡(heng)30min，避(bi)免溫(wen)差影(ying)響(xiang)試(shi)劑(ji)活性(xing)。

◦ 樣本(ben)處理：選(xuan)取(qu)1-2個代(dai)表性(xing)植(zhi)物(wu)樣本(ben)，按(an)試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)的樣本(ben)提(ti)取(qu)方法（如(ru)研磨(mo)、離心(xin)）制(zhi)備樣本(ben)上(shang)清(qing)液，確保(bao)無(wu)雜質(zhi)殘留。

◦ 器(qi)材準備(bei)：提前(qian)清(qing)洗(xi)酶標(biao)板、移(yi)液器(qi)吸頭(tou)，檢(jian)查酶(mei)標(biao)儀是否正常(chang)工(gong)作，設定(ding)好檢(jian)測(ce)波(bo)長。

2. 樣本(ben)稀(xi)釋度梯(ti)度設置(zhi)（0.5h）

◦ 取(qu)制(zhi)備好的(de)樣本(ben)上(shang)清(qing)液，用試(shi)劑(ji)盒配套(tao)的(de)稀(xi)釋液設(she)置(zhi)3-5個梯(ti)度稀釋度（如1:10、1:50、1:100、1:200、1:500），每(mei)個稀(xi)釋度做2個重(zhong)復孔，同(tong)時設置(zhi)空(kong)白(bai)對(dui)照孔（僅(jin)加稀(xi)釋液）和(he)標(biao)準品(pin)孔(kong)（按(an)說明(ming)書(shu)稀(xi)釋標(biao)準品(pin)）。

3. 加(jia)樣與(yu)孵育（1.5-2h）

◦ 按(an)順(shun)序(xu)向(xiang)酶標(biao)板各(ge)孔(kong)中加(jia)入50-100μL對(dui)應稀釋度的樣本(ben)、標(biao)準品(pin)或(huo)空(kong)白(bai)液，輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩酶(mei)標(biao)板使(shi)液體(ti)混(hun)勻，用封(feng)板膜密封(feng)。

◦ 將(jiang)酶標(biao)板放(fang)入37℃恒溫(wen)孵育箱(xiang)中孵育1-1.5h（具體(ti)時間(jian)以試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明書(shu)為準），讓抗(kang)原(yuan)與(yu)抗(kang)體(ti)充(chong)分結合。

4. 洗(xi)滌與(yu)加酶(mei)標(biao)抗(kang)體(ti)（1h）

◦ 孵育結(jie)束後，撕掉(diao)封板膜，棄(qi)去孔(kong)內液體(ti)，用洗(xi)滌液充(chong)分洗(xi)滌各孔(kong)（每(mei)孔(kong)加(jia)200-300μL洗(xi)滌液，靜(jing)置(zhi)30s後棄(qi)去），重(zhong)復洗(xi)滌3-5次，最(zui)後(hou)壹(yi)次洗(xi)滌後將(jiang)酶標(biao)板倒(dao)扣在(zai)吸水紙上拍幹，避免(mian)殘留液體(ti)影(ying)響(xiang)後(hou)續反應。

◦ 向各孔中(zhong)加入50-100μL酶標(biao)抗(kang)體(ti)，再(zai)次(ci)用封(feng)板膜密封(feng)，37℃恒(heng)溫(wen)孵育30min-1h。

5. 二次(ci)洗(xi)滌與(yu)加底(di)物（0.5h）

◦ 酶標(biao)抗(kang)體(ti)孵育結(jie)束後，重(zhong)復步驟4的(de)洗(xi)滌操(cao)作(zuo)，確保(bao)洗(xi)去未結(jie)合的酶標(biao)抗(kang)體(ti)。

◦ 立(li)即向各(ge)孔中(zhong)加(jia)入50-100μL底物(wu)溶(rong)液（如(ru)TMB），輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，37℃避(bi)光(guang)孵育10-20min，觀(guan)察(cha)孔(kong)內(nei)顏(yan)色變化(hua)（壹(yi)般陽(yang)性(xing)孔(kong)會(hui)逐(zhu)漸(jian)呈藍(lan)色）。

6. 終(zhong)止反應與(yu)讀(du)數（0.5h）

◦ 當(dang)標(biao)準品(pin)孔(kong)出現明(ming)顯梯(ti)度顏(yan)色時，向各(ge)孔(kong)中加入50μL終止液（如(ru)硫(liu)酸溶(rong)液），輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩混(hun)勻，孔(kong)內顏(yan)色會(hui)由藍(lan)色變為(wei)黃(huang)色(se)，終止反應。

◦ 10min內將酶標(biao)板放(fang)入酶標(biao)儀中(zhong)，在(zai)規定(ding)波(bo)長（如(ru)450nm）下(xia)測(ce)定(ding)各(ge)孔(kong)的吸光(guang)度（OD值），記(ji)錄數據。

7. 結果(guo)分析（1h）

◦ 根(gen)據標(biao)準品(pin)的(de)OD值(zhi)繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲(qu)線(xian)，計算(suan)出標(biao)準曲(qu)線(xian)的回歸(gui)方程(cheng)。

◦ 將(jiang)樣本(ben)各(ge)稀(xi)釋度的OD值(zhi)代(dai)入回歸(gui)方程(cheng)，計(ji)算(suan)出對(dui)應稀釋度下(xia)樣本(ben)的(de)目(mu)標(biao)物質(zhi)濃(nong)度，篩(shai)選(xuan)出OD值落在(zai)標(biao)準曲(qu)線(xian)線(xian)性(xing)範(fan)圍內(nei)（通(tong)常OD值在(zai)0.2-2.0之間(jian)）的(de)最(zui)佳(jia)樣本(ben)稀(xi)釋度。

◦ 同(tong)時觀(guan)察(cha)空(kong)白(bai)對(dui)照孔OD值(zhi)（應接(jie)近0）和(he)試(shi)劑(ji)反應情況，判斷(duan)試(shi)劑(ji)是否有(you)效(xiao)、樣本(ben)是否存在(zai)幹擾(rao)，確定(ding)正式(shi)實驗方案(an)。