人(ren)基(ji)質金(jin)屬蛋白酶3（MMP-3） ELISA檢測(ce)試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

試(shi)劑盒(he)采用雙(shuang)抗體(ti)壹(yi)步夾心法(fa)酶聯(lian)免疫(yi)吸(xi)附(fu)試(shi)驗(yan)（ELISA）。往預(yu)先包(bao)被(bei)基(ji)質金(jin)屬蛋白酶3（MMP-3）抗(kang)體(ti)的(de)包(bao)被(bei)微(wei)孔(kong)中(zhong)，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru)標本、標準品、HRP標記(ji)的(de)檢測(ce)抗體(ti)，經(jing)過(guo)溫育並徹(che)di洗滌(di)。用底物TMB顯色，TMB在(zai)過(guo)氧化物酶(mei)的(de)催化下(xia)轉化成(cheng)藍色，並在(zai)酸(suan)的(de)作用下(xia)轉化成(cheng)最終(zhong)的黃色。顏(yan)色的深(shen)淺(qian)和樣(yang)品中的基(ji)質金(jin)屬蛋白酶3（MMP-3）呈(cheng)正相(xiang)關。用酶(mei)標儀在(zai)450nm 波(bo)長下(xia)測(ce)定吸(xi)光度(du)（OD 值），計算(suan)樣品濃度(du)。

樣品收集、處理及(ji)保存方法(fa)

1.  血(xue)清：使用不含(han)熱(re)原(yuan)和內(nei)毒素(su)的試(shi)管(guan)，操作過(guo)程中避免(mian)任何(he)細(xi)胞(bao)刺激(ji)，收(shou)集血(xue)液後(hou)，3000轉(zhuan)離(li)心10分鐘(zhong)將(jiang)血(xue)清和紅細胞(bao)迅速(su)小心地分(fen)離(li)。

2.  血(xue)漿：EDTA、檸檬(meng)酸鹽(yan)或(huo)肝(gan)素(su)抗凝(ning)。3000轉離(li)心30分鐘(zhong)取(qu)上清。

3.  細胞(bao)上清液：3000轉(zhuan)離(li)心10分鐘(zhong)去(qu)除顆(ke)粒和聚(ju)合(he)物。

4.  組(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)：將(jiang)組(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)適量生(sheng)理鹽(yan)水(shui)搗碎。3000轉離(li)心10分鐘(zhong)取(qu)上清。

5.  保存：如(ru)果(guo)樣本收(shou)集後(hou)不及(ji)時(shi)檢測(ce)，請(qing)按壹(yi)次(ci)用量(liang)分(fen)裝(zhuang)，凍(dong)存於(yu)-20℃，避免(mian)反復凍融，在(zai)室溫下(xia)解凍(dong)並確(que)保樣品均勻(yun)地(di)充分解(jie)凍(dong)。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高(gao)精度(du)加樣(yang)器(qi)及(ji)槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒(heng)溫箱(xiang)

操作註意(yi)事項(xiang)

1.  試(shi)劑盒(he)保(bao)存在(zai)2-8℃，使用前室溫平衡(heng)20分(fen)鐘(zhong)。從冰箱(xiang)取(qu)出(chu)的濃(nong)縮洗(xi)滌液會(hui)有(you)結晶，這(zhe)屬於(yu)正常現象(xiang)，水(shui)浴(yu)加(jia)熱使結晶wan全溶(rong)解(jie)後(hou)再(zai)使用。

2.  實(shi)驗(yan)中不用的(de)板(ban)條應(ying)立(li)即放(fang)回自(zi)封袋(dai)中(zhong)，密(mi)封（低(di)溫幹(gan)燥）保(bao)存。

3.  濃(nong)度(du)為0的(de)S0號(hao)標準品即可(ke)視為陰性(xing)對照(zhao)或(huo)者空白；按照(zhao)說(shuo)明(ming)書(shu)操作時(shi)樣本(ben)已經稀(xi)釋(shi)5倍，最(zui)終(zhong)結果(guo)乘以5才(cai)是樣(yang)本(ben)實(shi)際(ji)濃(nong)度(du)。

4.  嚴(yan)格(ge)按(an)照說(shuo)明(ming)書(shu)中(zhong)標明的(de)時(shi)間(jian)、加(jia)液量(liang)及(ji)順序(xu)進行溫育操作。

5.  所有(you)液體(ti)組(zu)分(fen)使用前充分搖勻(yun)。

試(shi)劑盒(he)組(zu)成(cheng)

註：標準品（S0-S5）濃度(du)依次(ci)為(wei)：0、3、6、12、24、48 ng/mL

試(shi)劑的準(zhun)備

 20×洗(xi)滌(di)緩(huan)沖(chong)液的(de)稀(xi)釋(shi)：蒸(zheng)餾(liu)水按1：20稀(xi)釋(shi)，即(ji)1份(fen)的(de)20×洗滌緩(huan)沖(chong)液加(jia)19份(fen)的(de)蒸(zheng)餾(liu)水。

洗板(ban)方法(fa)

1.  手工(gong)洗(xi)板(ban)：甩盡孔(kong)內(nei)液體(ti)，每(mei)孔(kong)加(jia)滿(man)洗滌液，靜置(zhi)1min後(hou)甩盡孔(kong)內(nei)液體(ti)，在(zai)吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹(gan)，如(ru)此(ci)洗板(ban)5次(ci)。

2.  自(zi)動(dong)洗(xi)板(ban)機：每孔(kong)註入(ru)洗液350μL，浸(jin)泡(pao)1min，洗(xi)板(ban)5次(ci)。

操作步驟(zhou)

1.  從(cong)室溫平衡(heng)20min後(hou)的(de)鋁箔袋(dai)中(zhong)取出(chu)所需(xu)板(ban)條，剩(sheng)余(yu)板(ban)條用自(zi)封袋(dai)密(mi)封放(fang)回4℃。

2.  設(she)置(zhi)標準品孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)，標準品孔(kong)各(ge)加(jia)不同濃度(du)的標準品50μL；

3.  樣本孔(kong)先加(jia)待(dai)測(ce)樣本10μL，再(zai)加樣本稀(xi)釋(shi)液40μL；空(kong)白孔(kong)不加。

4.  除空(kong)白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣(yang)本孔(kong)中(zhong)每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)辣(la)根(gen)過(guo)氧化物酶(mei)（HRP）標記(ji)的(de)檢測(ce)抗體(ti)100μL，用封板(ban)膜(mo)封住反(fan)應(ying)孔(kong)，37℃水(shui)浴(yu)鍋(guo)或(huo)恒(heng)溫箱(xiang)溫育60min。

5.  棄去(qu)液體(ti)，吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹(gan)，每(mei)孔(kong)加(jia)滿(man)洗滌液，靜置(zhi)1min，甩去(qu)洗滌(di)液，吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹(gan)，如(ru)此(ci)重復洗(xi)板(ban)5次(ci)（也(ye)可(ke)用洗(xi)板(ban)機洗板(ban)）。

6.  每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵(fu)育15min。

7.  每孔(kong)加(jia)入(ru)終(zhong)止(zhi)液50μL，15min內(nei)，在(zai)450nm波(bo)長處測(ce)定各(ge)孔(kong)的(de)OD值。

結果(guo)判斷

 繪(hui)制(zhi)標準曲線：在(zai)Excel工(gong)作表(biao)中，以標準品濃度(du)作橫坐(zuo)標，對應(ying)OD值作縱坐(zuo)標，繪制(zhi)出(chu)標準品線性回歸(gui)曲線，按(an)曲線方程計算(suan)各(ge)樣(yang)本(ben)濃度(du)值。

試(shi)劑盒(he)性(xing)能(neng)

1.  準確性(xing)：標準品線性回歸(gui)與(yu)預(yu)期濃度(du)相(xiang)關系(xi)數(shu)R值，大於等於0.9900。

2.  靈敏度(du)：最di檢測(ce)濃度(du)小於1.0 ng/mL。

3.  特(te)異性(xing)：不與(yu)其(qi)它可(ke)溶(rong)性(xing)結構類似(si)物交(jiao)叉(cha)反(fan)應(ying)。

4.  重復性(xing)：板(ban)內(nei)、板(ban)間(jian)變異系(xi)數(shu)均小於15%。

5.  貯(zhu)藏：2-8℃，避光防潮(chao)保存。

6.  有(you)效(xiao)期：6個月

免責(ze)聲(sheng)明

1.   試(shi)劑盒(he)僅(jin)供(gong)研究使用，不得用於(yu)臨(lin)床實(shi)驗(yan)或(huo)人(ren)體(ti)實(shi)驗(yan)，否則(ze)所產(chan)生的壹(yi)切後果(guo)，由實(shi)驗(yan)者承擔，本公(gong)司概(gai)不負責(ze)。

2.   嚴(yan)格(ge)按(an)照說(shuo)明(ming)書(shu)操作，實(shi)驗(yan)者違(wei)反(fan)說(shuo)明(ming)書(shu)操作，後果(guo)由實(shi)驗(yan)者承擔。