豬(zhu)大腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）ELISA試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)

使(shi)用目的(de)：

本(ben)試(shi)劑(ji)盒用(yong)於(yu)測定豬(zhu)血清血漿及相關(guan)液體(ti)樣(yang)本(ben)中大(da)腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）表達。

實驗原理(li)

本(ben)試(shi)劑(ji)盒應(ying)用(yong)雙抗(kang)原夾心(xin)法(fa)測定標本(ben)中豬(zhu)大(da)腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）表達。用純(chun)化(hua)的(de)抗原(yuan)包被微孔板(ban)，制(zhi)成(cheng)固(gu)相抗原，可與(yu)樣(yang)品(pin)中大(da)腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）相結(jie)合(he)，經洗(xi)滌除去未結(jie)合(he)的(de)抗體(ti)和其(qi)他成分後(hou)再與(yu)HRP標記(ji)的(de)抗原(yuan)結(jie)合(he)，形(xing)成抗(kang)原(yuan)-抗(kang)體(ti)-酶(mei)標抗(kang)原復合物，經(jing)過(guo)徹(che)di洗(xi)滌後加(jia)底(di)物TMB顯色(se)。TMB在HRP酶(mei)的(de)催(cui)化(hua)下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍色(se)，並(bing)在酸的(de)作(zuo)用下(xia)轉化(hua)成(cheng)最(zui)終(zhong)的(de)黃色(se)。用酶(mei)標儀在450nm波(bo)長(chang)下(xia)測定吸光(guang)度(du)（OD值），與(yu)CUTOFF值相比(bi)較(jiao)，從(cong)而判定標本(ben)中豬(zhu)大(da)腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）的(de)存在(zai)與(yu)否(fou)。

試(shi)劑(ji)盒組(zu)成(cheng)

標本(ben)要求

1．標本(ben)采(cai)集後(hou)盡早進(jin)行提(ti)取(qu)，提(ti)取(qu)按(an)相(xiang)關(guan)文(wen)獻(xian)進(jin)行，提(ti)取(qu)後(hou)應(ying)盡快進(jin)行實驗。若(ruo)不能馬(ma)上進(jin)行試(shi)驗，可將(jiang)標本(ben)放於(yu)-20℃保存，但(dan)應避免(mian)反(fan)復凍(dong)融(rong)

2．不能檢(jian)測(ce)含(han)NaN3的(de)樣(yang)品(pin)，因NaN3抑制(zhi)辣根(gen)過(guo)氧化(hua)物酶(mei)的(de)（HRP）活(huo)性。

操(cao)作(zuo)步驟(zhou)

1. 編號：將(jiang)樣(yang)品(pin)對(dui)應(ying)微孔按序編號，每板(ban)應(ying)設陰性對(dui)照2孔、陽(yang)性對(dui)照2孔、空白對(dui)照1孔（空白對(dui)照孔不加樣(yang)品(pin)及酶(mei)標試(shi)劑(ji)，其(qi)余(yu)各(ge)步(bu)操(cao)作(zuo)相同(tong)）

2. 加樣(yang)：分(fen)別(bie)在陰、陽(yang)性對(dui)照孔中加(jia)入陰性對(dui)照、陽(yang)性對(dui)照50μl。然後(hou)在(zai)待測(ce)樣(yang)品(pin)孔先(xian)加(jia)樣(yang)品(pin)稀(xi)釋液(ye)40μl，然(ran)後再加待測(ce)樣(yang)品(pin)10μl。加樣(yang)將(jiang)樣(yang)品(pin)加於(yu)酶(mei)標板(ban)孔底部(bu)，盡量不觸及孔壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃(huang)動(dong)混(hun)勻，

3. 溫(wen)育(yu)：用(yong)封板(ban)膜(mo)封板(ban)後(hou)置(zhi)37℃溫(wen)育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

4. 配(pei)液(ye)：將30倍濃(nong)縮洗(xi)滌液用(yong)蒸(zheng)餾水30倍(bei)稀(xi)釋後(hou)備用

5. 洗(xi)滌：小(xiao)心(xin)揭(jie)掉(diao)封板(ban)膜(mo)，棄(qi)去液(ye)體(ti)，甩(shuai)幹，每孔加滿洗(xi)滌液，靜置(zhi)30秒(miao)後棄(qi)去，如(ru)此重(zhong)復5次，拍(pai)幹。

6. 加(jia)酶(mei)：每孔加入酶(mei)標試(shi)劑(ji)50μl，空白孔除外(wai)。

7. 溫(wen)育(yu)：操(cao)作(zuo)同(tong)3。

1. 洗(xi)滌：操作(zuo)同(tong)5。

2. 顯色(se)：每孔先(xian)加(jia)入顯色(se)劑(ji)A50μl，再加入顯色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕震蕩(dang)混勻，37℃避(bi)光(guang)顯色(se)10分鐘(zhong).

3. 終(zhong)止(zhi)：每孔加終止(zhi)液(ye)50μl，終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)（此時(shi)藍色(se)立(li)轉(zhuan)黃色(se)）。

4. 測定(ding)：以空白孔調零，450nm波(bo)長依(yi)序測(ce)量各(ge)孔的(de)吸光(guang)度(du)（OD值）。 測定應在加終止(zhi)液(ye)後(hou)15分(fen)鐘(zhong)以(yi)內(nei)進(jin)行。

計(ji)算和結(jie)果判定(ding)：

試(shi)驗有效性：陽(yang)性對(dui)照孔平(ping)均值≥1.00; 陰性對(dui)照平(ping)均值≤0.20

臨(lin)界值（CUT OFF）計算：臨(lin)界值=陰性對(dui)照孔平(ping)均值+0.15

陰性判(pan)定(ding)：樣(yang)品(pin)OD值< 臨(lin)界值（CUT OFF）者為(wei)大腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）陰性

陽(yang)性判(pan)定(ding)：樣(yang)品(pin)OD值≥ 臨(lin)界值（CUT OFF）者為(wei)大腸桿(gan)菌病(bing)F型特(te)異(yi)性抗(kang)體(ti)IgY（E.coli-F sIgY）陽(yang)性。

註(zhu)意事項

1．操(cao)作(zuo)嚴(yan)格(ge)按照說(shuo)明(ming)書(shu)進(jin)行，本(ben)試(shi)劑(ji)不同(tong)批號組(zu)分(fen)不得混(hun)用(yong)。

2．試(shi)劑(ji)盒從(cong)冷(leng)藏(zang)環(huan)境(jing)中取(qu)出(chu)應(ying)在室溫(wen)平(ping)衡(heng)15-30分(fen)鐘(zhong)後(hou)方(fang)可(ke)使用，酶(mei)標包被板(ban)開封後(hou)如(ru)未用(yong)完(wan)，板(ban)條(tiao)應(ying)裝(zhuang)入密封袋(dai)中保(bao)存。

3．濃(nong)洗(xi)滌液可(ke)能(neng)會有(you)結(jie)晶(jing)析出(chu)，稀(xi)釋時(shi)可(ke)在水(shui)浴(yu)中加(jia)溫(wen)助(zhu)溶(rong)，洗(xi)滌時不影響(xiang)結(jie)果。

4． 封板(ban)膜(mo)只(zhi)限(xian)壹(yi)次(ci)性(xing)使(shi)用(yong)，以(yi)避(bi)免(mian)交叉汙(wu)染。

5．底(di)物請(qing)避(bi)光(guang)保(bao)存。

6．試(shi)驗結(jie)果判定(ding)必須以酶(mei)標儀讀數(shu)為(wei)準，使用(yong)雙波(bo)長(chang)檢(jian)測(ce)時，參考波(bo)長(chang)為(wei)630nm

7．所有(you)樣(yang)品(pin)，洗(xi)滌液和各(ge)種廢(fei)棄(qi)物都應按傳染物處(chu)理(li)。終止(zhi)液(ye)為(wei)2M的(de)硫酸，使用(yong)時必須註意安(an)全(quan)。

保存條(tiao)件及有效期

1．試(shi)劑(ji)盒保(bao)存：；2-8℃。

2．有(you)效期：6個(ge)月(yue)