深度(du)剖析(xi)ELISA試劑操(cao)作(zuo)常見(jian)問(wen)題及(ji)解決方(fang)案

壹、為什(shen)麽(me)所(suo)有試劑和檢(jian)測(ce)樣本要(yao)平(ping)衡至室溫(wen)後再(zai)進行(xing)加(jia)樣操(cao)作(zuo)？

溫度(du)是(shi)ELISA試劑盒(he)結(jie)合反(fan)應(ying)的(de)重要(yao)影(ying)響因(yin)素。為了(le)使所(suo)有樣本在壹(yi)致的(de)溫度(du)下(xia)反應(ying)，實驗(yan)前(qian)務必將(jiang)所(suo)有試劑平(ping)衡至室溫(wen)，包(bao)括(kuo)檢(jian)測(ce)樣本。避(bi)免因(yin)溫度(du)的(de)動(dong)力(li)學反(fan)應(ying)差(cha)異而(er)導(dao)致ELISA檢(jian)測(ce)結(jie)果的(de)不準(zhun)確(que)。

二(er)、如何獲得(de)良(liang)好(hao)線性的(de)標準(zhun)曲線？

按(an)照(zhao)推(tui)薦(jian)方(fang)式(shi)保存標準(zhun)品(pin)；溶(rong)解標準(zhun)品(pin)之前需(xu)短(duan)暫(zan)離(li)心(xin)，收(shou)集粉末(mo)；確(que)保標準(zhun)品(pin)溶(rong)解和混勻(yun)（大約(yue)10min），然(ran)後再(zai)進行(xing)後(hou)續的(de)系列稀釋步(bu)驟(zhou)，確保每壹(yi)步(bu)都充分混勻(yun)且(qie)精確移(yi)液；顯色的(de)恰當終止；選擇(ze)合適(shi)的(de)數學擬合方(fang)程(cheng)繪(hui)制(zhi)標準(zhun)曲線。

三、ELISA實驗(yan)為(wei)什麽(me)必須(xu)設(she)置復(fu)孔？

為獲得(de)更(geng)準(zhun)確(que)的(de)實驗(yan)結(jie)果，強(qiang)烈建議(yi)標準(zhun)品(pin)及(ji)樣本進行(xing)復(fu)孔(kong)檢(jian)測(ce)。因(yin)為復(fu)孔(kong)檢(jian)測(ce)可以：

計(ji)算(suan)平(ping)均(jun)值(zhi)，確(que)保實驗(yan)結(jie)果更(geng)準(zhun)確(que)；

解(jie)決實驗(yan)中(zhong)誤(wu)操(cao)作(zuo)造成(cheng)的(de)跳孔現象(xiang)；

計算(suan)CV值(zhi)，對(dui)實驗(yan)的(de)操(cao)作(zuo)和試劑盒(he)的(de)精密(mi)度(du)進行(xing)評(ping)估(gu)。

四、為什麽實驗(yan)過(guo)程(cheng)中(zhong)孵(fu)育、洗(xi)滌(di)需(xu)要(yao)振蕩(dang)？如何振蕩(dang)？

振蕩(dang)孵(fu)育使(shi)反應(ying)更充分，振蕩(dang)洗(xi)滌(di)使(shi)背景更(geng)幹凈(jing)。建(jian)議(yi)使用酶(mei)標專用96孔微(wei)孔板(ban)振蕩(dang)器(qi)。

孵(fu)育過(guo)程(cheng)振蕩(dang)，可(ke)以加(jia)快、加強(qiang)抗原(yuan)抗體(ti)分(fen)子(zi)間(jian)的(de)相互碰(peng)撞(zhuang)接(jie)觸(chu)，使得(de)反(fan)應過(guo)程(cheng)更(geng)加完(wan)善，OD值(zhi)通(tong)常(chang)會比未振蕩(dang)孵(fu)育的(de)結(jie)果要(yao)高(gao)；洗(xi)滌(di)過(guo)程(cheng)振蕩(dang)，可(ke)以使(shi)洗(xi)板(ban)更幹凈(jing)，在(zai)很大程(cheng)度(du)上 能降(jiang)低(di)背景值(zhi)，同(tong)時(shi)可(ke)以提(ti)高(gao)試劑盒(he)檢(jian)測(ce)的(de)靈敏(min)度(du)。

五、何時(shi)終止ELISA反應？

ELISA實驗(yan)最終需(xu)要(yao)酶(mei)催(cui)化(hua)底物(wu)顯(xian)色反(fan)應來(lai)完(wan)成(cheng)，實驗(yan)成(cheng)功(gong)的(de)重要(yao)因(yin)素。在HRP-TMB酶(mei)促反應系(xi)統(tong)中，S5出現淡(dan)藍(lan)色，S1 – S3有明顯(xian)的(de)階梯型(xing)藍(lan)色，便(bian)需(xu)要(yao)終止反應；或者(zhe)根(gen)據(ju)最高(gao)濃(nong)度(du)標準(zhun)品(pin)孔(kong)在(zai)620nm的(de)OD值(zhi)來(lai)決定，OD620=0.9-0.95之間時(shi)即可終止。

六、為什(shen)麽酶(mei)標儀讀數時(shi)必須(xu)選用雙波(bo)長？

首(shou)先(xian)，酶(mei)標儀使用前務(wu)必預(yu)熱(re)10-15min，使測(ce)讀結(jie)果更(geng)穩定。其次，ELISA實驗(yan)采(cai)用雙波(bo)長測(ce)定吸光度(du)，可以排(pai)除單(dan)波(bo)長檢(jian)測(ce)時(shi)的(de)測(ce)定幹擾(rao)（標本的(de)濃度(du)，幹擾(rao)色等(deng)）。壹般采用最大波(bo)長作(zuo)為參(can)照(zhao)波(bo)長，在(zai)參(can)照(zhao)波(bo)長下(xia)，檢(jian)測(ce)物(wu)的(de)吸光值(zhi)最小，檢(jian)測(ce)波(bo)長和參照(zhao)波(bo)長的(de)吸光值(zhi)之差可以消除非(fei)特異性吸收(shou)；因(yin)此(ci)，雙(shuang)波(bo)長測(ce)定，可最大限度(du)的(de)消除指(zhi)紋(wen)、雜質及(ji)不透光的(de)物(wu)質(zhi)對酶(mei)標儀讀數帶來(lai)的(de)誤(wu)差，以保(bao)證(zheng)實驗(yan)數據的(de)準(zhun)確(que)度(du)。

以上是(shi)深圳瑞(rui)清(qing)生物(wu)ELISA試劑盒(he)操(cao)作(zuo)常見(jian)問(wen)題及(ji)解決方(fang)案，望對(dui)您(nin)的(de)科研事業(ye)提(ti)供幫助！

更(geng)多實驗(yan)資訊(xun)可咨詢(xun)我(wo)司(si)業(ye)務員(yuan)。深圳瑞(rui)清(qing)生物(wu)科技(ji)有限公司(si)擁(yong)有自(zi)己的(de)實驗(yan)室(shi)，備有專業(ye)的(de)技(ji)術研發(fa)團(tuan)隊，長(chang)期致力(li)於各(ge)種(zhong)生物(wu)試劑，細(xi)胞，血清(qing)，ELISA試劑盒(he)的(de)研發與(yu)銷售(shou)，實驗(yan)提(ti)供免費(fei)代測(ce)服(fu)務，並提(ti)供jing湛(zhan)的(de)技(ji)術服(fu)務，如果您(nin)有實驗(yan)上的(de)問(wen)題歡迎(ying)來(lai)dian咨詢(xun)，為(wei)您提(ti)供專業(ye)的(de)壹對壹(yi)技(ji)術指導(dao)。